K88菌毛细胞表面呈现载体的初步研究

发布时间：2018-01-16 09:52

  本文关键词：K88菌毛细胞表面呈现载体的初步研究　出处：《石河子大学》2008年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： 肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic E .coli,简称ETEC)是引起婴幼儿和新生仔猪腹泻的主要病原之一。其致病性决定于它在宿主小肠上皮细胞上的定居能力和产肠毒素的能力。ETEC定居宿主小肠上皮细胞的能力是由菌体表面的菌毛介导。细胞表面呈现技术是近来年在针对菌毛的疫苗研究中发展起来的一种新方法。将编码菌毛的基因在非毒素源性大肠杆菌中表达并使菌毛在细胞表面组装成菌毛,菌毛以完整形式在细胞表面出现,而且菌毛抗原蛋白以多聚体的形式存在,将增强菌毛抗原的免疫原性。而且可在细胞表面获得含有外源抗原表位的杂合菌毛,即所谓的细胞表面呈现,这是一种构建多价活疫苗的理想途径。 本实验以Long and Accurate PCR技术扩增K88菌毛操纵子的结构基因faeC-faeH并克隆到pBR322质粒载体中,设计合成一段含ApaI和NcoI酶切位点的DNA序列,与SacI和BssHII酶切后的包含结构基因faeC-faeH的质粒连接;设计合成耐热肠毒素STII表位编码序列和口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1的201-200AA的线性表位编码序列,与ApaI和NcoI酶切后的载体连接,构建融合基因。用特异性引物PCR扩增fae操纵子的调控基因faeA和faeB及faeB上游的启动子区域,并对所得序列进行序列分析和生物信息学分析。PCR扩增STI-STII融合基因,选择正向连接的克隆T-STI-STII,XhoI酶切后补平,与XhoI、SalI酶切后的T-LTB的小片段连接,构建T-STI-STII-LTB质粒;BamHI、SacI双酶切T-STI-STII-LTB后与pET28a连接,构建原核表达载体。转化大肠杆菌BL21(DE3)后表达,SDS-PAGE确定最佳诱导时间和最佳IPTG浓度。 实验PCR获得了K88菌毛操纵子的结构基因faeC-faeH并克隆到pBR322质粒载体中得到重组质粒pBR-fae1,在pBR-fae1中引入了ApaI和NcoI酶切位点得到了质粒pBR-fae2;在pBR-fae2的ApaI和NcoI处融合STII表位和FMDV VP1表位,成功构建了pBR-fae-STII和pBR-fae-VP1质粒。克隆了fae操纵子的负调控基因faeA。对K88ab、K88ac两个血清型的faeA序列分析结果显示,两个血清型之间不存在差异;生物信息学分析结果显示,faeA基因表达产物FaeA与其他大肠杆菌菌毛操纵子的负调控蛋白序列比较发现,FaeA与其他FaeA样负调控蛋白同时存在一个7个氨基酸的保守区。实验还得到了正调控基因faeB及其启动子区域和上游调控序列;对其序列分析后显示,在faeB基因上游的序列中包含启动子的特征序列-35区和-10区,同时存在与菌毛表达调控相关的三个GATC甲基化位点。将大肠杆菌耐热性肠毒素ST和不耐热性肠毒素LT的B亚单基因融合,构建了原核表达载体pET28a-STI-STII-LTB,转化大肠杆BL21(DE3)后诱导表达。加入IPTG至终浓度为0.8mM诱导,诱导表达后的菌体蛋白行SDS-PAGE,电泳结果显示融合基因得到高效表达并且当诱导时间为4h时表达量达到最高。 pBR-fae-STII和pBR-fae-VP1质粒载体的构建和两个调控基因的获得为在非毒素源性大肠杆菌菌毛上呈现外源表位奠定了基础。表达的STI-STII-LTB蛋白为获得具有强免疫原性的ST蛋白用以后续的实验中制备ST的抗体检测呈现的STII表位,提供了必要的准备。
[Abstract]:Enterotoxin E . coli ( ETEC ) is one of the main pathogens causing diarrhea in infants and newborn piglets . Its pathogenicity depends on its ability to colonize the small intestinal epithelial cells and the ability to produce enterotoxins . The structural gene faeC - faeH of K88 colony operon was amplified by Long and Polymerase Chain Reaction ( PCR ) and cloned into the plasmid vector of 322 plasmid . The DNA sequence containing ApaI and NcoI was designed and synthesized . It was ligated with the vector containing structural gene faeC - faeH after digestion with SacI and BssHII . The recombinant plasmid pBR - fae1 was cloned into the plasmid pBR - fae1 . The expression vector pET28a - fae - STII and pBR - fae - VP1 was constructed . Construction of pBR - fae - STII and pBR - fae - VP1 plasmid vectors and the acquisition of two regulatory genes provide the basis for the presentation of foreign epitopes on non - toxin - derived Escherichia coli pili . The expressed STI - STII - LTB protein provides the necessary preparation for obtaining STII epitopes for antibody detection of ST in subsequent experiments .

【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：S852.61;R378

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本文编号：1432590