热休克蛋白70与p53相关载体构建及其在HepG2细胞系中共定位关系的研究

发布时间：2018-01-16 13:10

  本文关键词：热休克蛋白70与p53相关载体构建及其在HepG2细胞系中共定位关系的研究　出处：《第四军医大学》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： 热休克蛋白(heat shock protein HSPs)是细胞在不良环境因素作用下产生的一组重要的应激蛋白,它能保护机体(或细胞)不受或少受伤害。许多研究发现它在肿瘤,特别是恶性肿瘤中常有高表达。肿瘤细胞中的突变和异常蛋白质刺激hsp70的合成,使其呈现持续的高诱导表达,参与肿瘤的发生发展过程。它能与癌基因、抑癌基因产物结合,具有抗肿瘤和细胞凋亡的作用。 肿瘤发生发展是一个多基因参与的多步骤的复杂过程,抑癌基因可能是抵御肿瘤发生的重要的保护机制。只要它们具有完整的活性,就可以有效抑制肿瘤的发生。P53是一个研究较早的抑癌基因,p53基因突变在约50%的恶性肿瘤中都存在。热休克蛋白能与多种癌基因产物结合形成蛋白复合体,从而参与细胞转化过程。已经有大量文献报道在宫颈癌、乳腺癌、骨肉瘤组织中证实存在hsp70-p53复合物。热休克蛋白70与突变p53之间有一定相关性,这可能是突变型p53(mp53)半衰期延长的原因之一。热休克蛋白通过影响mtp53而参与肿瘤细胞的细胞周期调控及增殖,促进肿瘤细胞生长。我们实验室近年的研究发现在人肝细胞肝癌(HCC)组织中有多种热休克蛋白表达,其中部分hsp70与p53之间具有细胞核定位关系,并用免疫共沉淀方法证实了二者的相互结合。 本实验在前期实验的基础上利用定点突变合成p53基因突变子,并构建绿色荧光蛋白表达载体,进而观察其在HepG2细胞中与内源性热休克蛋白70的共定位关系。结果发现HepG2细胞中有内源性hsp70的高表达,并且定位于细胞质中。含有p53的荧光蛋白表达载体转入HepG2内可观察到野生型p53、249位点突变的p53均定位于细胞核,273位点突变的p53与hsp70共定位于细胞质。p53的不同定位可能与其定点突变后改变蛋白构型遮盖其C末端核定位信号(nuclear localization signal NLS)有关。Hsp70作为分子伴侣与点突变的p53存在相互作用,通过p53不同的细胞内定位引起部分hsp70相伴定位于细胞核。Hsp70与不同的点突变p53基因有不同的定位,且与273位点突变的p53主要共定位于细胞质,这一结果与我们发现的肝癌组织中的两者主要定位于细胞核相矛盾,这些均提示hsp70与p53在细胞核的定位与两者的相互作用关系存在某种机制。为进一步研究热休克蛋白70对肝癌细胞系HepG2生物学行为的影响以及其与p53的关系,我们利用腺病毒包装系统以及慢病毒干涉载体系统,分别构建了含有热休克蛋白70基因的重组腺病毒载体以及针对热休克蛋白70的慢病毒干涉载体,成功包装出含有热休克蛋白70基因的腺病毒颗粒并感染HepG2细胞,腺病毒的成功包装及慢病毒载体的成功构建为以后的实验奠定了一个良好的研究基础。
[Abstract]:Heat shock protein (shock protein HSPs) is an important group of stress proteins produced by cells under adverse environmental factors. It can protect the body (or cell) from injury or injury. Many studies have found that it is often overexpressed in tumor, especially in malignant tumor. Mutation and abnormal protein in tumor cells stimulate the synthesis of hsp70. It can combine with oncogene and tumor suppressor gene product and has the function of anti-tumor and apoptosis. Tumorigenesis and development is a complex process involving multiple genes. Tumor suppressor genes may be an important protective mechanism against tumorigenesis as long as they have complete activity. P53 is an earlier tumor suppressor gene. P53 gene mutations are present in about 50% malignant tumors. Heat shock proteins (HSPs) can bind to multiple oncogene products to form protein complexes. Thus participate in the process of cell transformation. There have been a lot of literature in cervical cancer, breast cancer. Hsp70-p53 complex was found in osteosarcoma tissues. There was a correlation between heat shock protein 70 (HSP70) and mutant p53. This may be one of the reasons for the prolonged half-life of mutant p53mp53. Heat shock proteins (HSPs) are involved in the regulation of cell cycle and proliferation of tumor cells by affecting mtp53. Our laboratory research in recent years has found that there are a variety of heat shock proteins expressed in human hepatocellular carcinoma (HCC) tissues. Some of them had nuclear localization relationship between hsp70 and p53, and their binding was confirmed by immunoprecipitation. On the basis of previous experiments, p53 gene mutants were synthesized by site-directed mutagenesis and green fluorescent protein expression vector was constructed. The co-localization of endogenous heat shock protein 70 (HSP70) in HepG2 cells was observed. The results showed that there was a high expression of endogenous hsp70 in HepG2 cells. The fluorescent protein expression vector containing p53 was transferred into HepG2 and the mutation of wild type p53n249 was observed in the nucleus. The different localization of p53 and hsp70 co-located in cytoplasm. P53 may be related to the alteration of protein configuration after site-directed mutation to cover its C-terminal nuclear localization signal (P < 0.05). Nuclear localization signal NLS). Hsp70 as a molecular chaperone interacts with point mutant p53. By different intracellular localization of p53, some hsp70 concomitant loci were located in the nucleus. Hsp70 had different localization with different point mutation p53 gene. P53 with 273 mutation is mainly located in the cytoplasm, which is inconsistent with the nuclear localization in the liver cancer tissues we found. These results suggest that there is a mechanism between the nuclear localization of hsp70 and p53 and their interaction. To further study the effect of heat shock protein 70 on the biological behavior of hepatocellular carcinoma cell line HepG2. And its relationship with p53. We constructed recombinant adenovirus vector containing heat shock protein 70 gene and lentivirus interference vector targeting heat shock protein 70 using adenovirus packaging system and lentivirus interference vector system respectively. Adenovirus particles containing heat shock protein 70 gene were successfully packaged and infected with HepG2 cells. The successful packaging of adenovirus and the successful construction of lentivirus vector laid a good foundation for future experiments.
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R346

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本文编号：1433254