C57小鼠肝脏内质网蛋白质翻译后修饰研究

发布时间：2018-01-16 21:02

本文关键词：C57小鼠肝脏内质网蛋白质翻译后修饰研究　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2008年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 内质网是细胞中重要的细胞器结构,细胞无论是自身正常的生理变化还是由于对环境的应激反应而使蛋白质产生上调或下调的变化,大部分都要通过内质网来实现,这是因为细胞内质网负责合成分泌到细胞外或是定位到细胞膜、线粒体和溶酶体等细胞器的蛋白质。另外细胞大部分的脂类都在内质网中合成;内质网还担负着细胞解毒和钙离子储存等功能。在目前已知的蛋白质200多种翻译后修饰中,糖基化修饰和磷酸化修饰是最为主要和分布最广的翻译后修饰方式。蛋白质糖基化修饰极大程度地改变了蛋白质的理化性质:分子量增加、溶解性增大等;并影响着蛋白质的功能。细胞内50%的蛋白质是糖基化修饰蛋白质,对生物样本中糖蛋白的修饰位点和糖型进行系统的研究,有助于阐明由于糖基化位点或是糖型改变引起的疾病的发病机理。但是由于糖基化修饰本身存在微不均一性等特点,使糖基化修饰成为目前蛋白质组研究的难点之一。蛋白质的磷酸化修饰在生命活动中具有重要的调控作用,它几乎涉及所有的生理及病理过程,如代谢、细胞的生长发育、癌变等,是目前蛋白质组中翻译后修饰研究的热点,系统地对生物样本中磷酸化蛋白质组进行研究,有助于阐明磷酸化介导的生理病理机制;但是磷酸化蛋白质在样本中含量低且动态范围广,这些特点决定了其相关研究的挑战性。本文以C57小鼠肝脏内质网为模式样本,对内质网蛋白质的N-糖基化修饰和磷酸化修饰进行了研究。论文第一部分建立了基于ConA富集的内质网N-糖蛋白质组研究策略。ConA是特异性较好的凝集素,在N-糖修饰蛋白质的研究中广泛使用,为了更好的富集生物样品中低丰度的N-糖修饰蛋白质,我们首先对ConA的使用条件进行了优化,并把优化后的使用条件用于内质网N-糖修饰的研究。采用密度梯度离心方法提取小鼠肝脏内质网,并利用ConA富集其中的N-糖修饰蛋白质,通过高准确度的线性离子阱-傅立叶变换回旋共振质谱(LTQ-FTICR-MS)对提取的N-糖修饰蛋白质进行了鉴定和修饰位点确认。实验分别在样品水平和质谱水平各进行了三次重复,得到了9批数据,从这9批数据中共鉴定了属于212个蛋白的309个糖基化肽段,含有323个糖基化修饰位点,其中有81个蛋白质的糖基化修饰位点未被Swissprot库收录。论文第二部分以9种标准蛋白质及线粒体蛋白质为样本,优化了富集磷酸化肽段的SCX技术路线,并将优化后的SCX富集路线应用于小鼠肝脏内质网蛋白质的磷酸化研究。在质谱水平进行了3次重复鉴定,得到3批数据,从这3批数据中共鉴定到了249个磷酸化位点,分属于161个磷酸化蛋白质的164个磷酸化肽段。其中有125个蛋白质的磷酸化修饰位点未被Swissprot库收录。分析发现其中很多磷酸化蛋白质在生物体中发挥着与肝脏的生理和病理密切相关的重要功能。本研究建立了基于ConA富集的N-糖蛋白质研究策略,同时优化了基于SCX富集的磷酸化研究策略,首次建立了N-糖基化蛋白质修饰谱和小鼠肝脏内质网磷酸化蛋白质修饰谱,为研究N-糖基化修饰、磷酸化修饰在内质网中的功能发挥及内质网相关功能的研究奠定了基础。
[Abstract]:The endoplasmic reticulum ( ER ) is an important organelle structure in the cell , and the changes of the protein production up - regulated or down - regulated due to the stress response to the environment , most of which are to be realized through the endoplasmic reticulum , because the endoplasmic reticulum of the cell is responsible for the synthesis of the protein secreted into the cell or the organelle such as the cell membrane , mitochondria and lysosomes . Glycation modification and phosphorylation modification are the most important and widely distributed post - translational modifications in the currently known protein 200 . The protein glycosylation modification greatly alters the physical and chemical properties of proteins : the increase of molecular weight , the increase of solubility , etc . In this paper , the N - glycosylation modification and phosphorylation modification of the endoplasmic reticulum protein were studied by taking C57 mouse liver endoplasmic reticulum as a model sample . In the first part , we have established the research strategy of N - sugar protein in the endoplasmic reticulum , which is based on the concentration of N - sugar . In order to enrich the N - sugar modified protein with low abundance in biological sample , we first optimize the use condition of Con A and use the optimized conditions for N - sugar modification of endoplasmic reticulum . In the second part , nine standard proteins and mitochondrial proteins were used as samples to optimize the SCX technology route for enriching phosphorylated peptide segments , and the optimized SCX enrichment route was applied to the phosphorylation of protein in liver endoplasmic reticulum . In this paper , we established a research strategy of N - sugar protein based on concanavalin enrichment , meanwhile , optimized the phosphorylation research strategy based on SCX enrichment , established the modified spectrum of N - glycosylation protein modification and the phosphorylation protein modification of mouse liver endoplasmic reticulum , and laid a foundation for the study of the function of N - glycosylation modification and phosphorylation modification in the endoplasmic reticulum and the related function of endoplasmic reticulum .

【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R341

【相似文献】