慢性乙型肝炎治疗型MVA载体疫苗的基础研究
本文关键词：慢性乙型肝炎治疗型MVA载体疫苗的基础研究 出处：《中国人民解放军军医进修学院》2008年博士论文 论文类型：学位论文
【摘要】： 由于DNA疫苗在诱导机体特异性细胞免疫方面具有独特优势,已作为针对慢性乙型肝炎具有潜力的免疫治疗手段被广泛研究。如何加强DNA疫苗的效果是推动DNA疫苗发展的关键。其中一个研究方向就是通过选择佐剂和调整免疫程序加强DNA疫苗的保护效率。 异源性载体prime/boost免疫策略是利用不同性质的载体表达同一个保护抗原,一般是DNA疫苗初次免疫(prime),然后用病毒载体加强(boost)。DNA疫苗抗原纯度高,持续表达低剂量的抗原,可多次重复免疫以及诱导高效价记忆性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,是理想的用于初次免疫的疫苗;重组病毒能高效表达目的抗原,模拟病毒感染诱导机体免疫的天然过程,能诱发多种细胞因子,而且有利于高亲和性抗体和T细胞受体的选择,可以有效地产生Th1型和CTL反应。 白细胞介素18(IL-18)最早被称为IFN-γ诱导因子γ,它不仅能促进T细胞和NK细胞产生IFN-γ、IL-2和GM-CSF等细胞因子,并能增强Th1细胞和NK细胞表达Fas配体,从而介导细胞毒作用。 本课题在构建含HBV不同抗原基因的重组MVA假病毒颗粒的基础上,采取DNA prime/VLP boost的免疫程序,辅以细胞因子IL-18作为佐剂,评价其治疗HBV慢性感染的可能价值。 首先将表达乙型肝炎病毒PreS2-S、C、PreC/C等抗原基因,以及分别突变2个和4个核苷酸的PreC/C基因分别克隆入与痘苗病毒Ankara株(MVA)基因组同源的穿梭载体pSC11中,构建并筛选重组质粒,将所得转染MVA病毒经过9次传代培养,筛选分别携带这些目的基因的重组MVA病毒,通过PCR扩增证实重组病毒分别正确携带目的基因,并且在传代过程中成功形成单克隆,间接免疫荧光鉴定重组病毒可以被所表达抗原的特异性抗体识别,证实重组病毒正确表达目的抗原并具有良好的抗原性。 大量制备DNA疫苗、重组病毒以及鼠白细胞介素-18(mIL-18)质粒,分别采用DNA疫苗单独免疫、rMVA单独免疫、DNA prime/rMVA boost、DNA prime/rMVAboost+mIL-18的免疫程序免疫C57BL/6小鼠,采用ELISA、ELISPOT方法评价体液免疫和细胞免疫的效果。结果显示,表达PreS2-S、C两种抗原的各组疫苗在抗体产生的时间和滴度方面均没有统计学差异,用ELISPOT检测IFN-γ的产生可知,所有免疫组均可引起针对特异性抗原的细胞免疫,rMVA单独免疫组强于DNA疫苗单独免疫组,弱于DNA prime/rMVA boost和DNA prime/rMVAboost+mIL-18组,DNA prime/rMVA boost和DNA prime/rMVA boost+mIL-18之间没有显著差别。 研究表明,携带HBV保护性抗原基因的重组MVA病毒可以诱导针对抗原的特异性细胞免疫和体液免疫,将其与表达相同抗原的DNA疫苗联合,采用DNAprime/rMVA boost的免疫方案,可以诱导比两者单独应用更强的细胞免疫反应,实验结果将为治疗型HBV疫苗的应用研究提供科学依据。
[Abstract]:Because of the unique advantages of DNA vaccine in inducing specific cellular immunity. Has been widely studied as a potential immunotherapy for chronic hepatitis B. how to enhance the effectiveness of DNA vaccine is the key to promote the development of DNA vaccine. One of the research directions is through the selection of adjuvants. And adjusts the immune program to enhance the DNA vaccine protection efficiency. The strategy of heterogenous vector prime/boost immunization is to express the same protective antigen by using different vectors, which is usually the prime of primary immunization of DNA vaccine. Then the virus vector was used to enhance the antigen purity of boost.DNA vaccine and the low dose antigen was continuously expressed. The vaccine can be repeated multiple times and induce high titer memory cytotoxic T lymphocyte cytotoxic T lymphocyte (CTL) reaction. It is an ideal vaccine for primary immunization. The recombinant virus can express the target antigen efficiently, mimic the natural process of virus infection and induce many cytokines, and is beneficial to the selection of high affinity antibody and T cell receptor. Th1 type and CTL reaction can be produced effectively. Interleukin-18 (IL-18) was first called IFN- 纬 inducible factor 纬 (IFN- 纬 -inducible factor 纬), which can not only promote the production of cytokines such as IFN- 纬 -IL-2 and GM-CSF by T cells and NK cells. It can also enhance the expression of Fas ligand in Th1 cells and NK cells, thus mediating cytotoxicity. Based on the construction of recombinant MVA pseudovirus particles containing different antigen genes of HBV, the immune program of DNA prime/VLP boost was adopted. To evaluate the possible value of cytokine IL-18 as adjuvant in the treatment of chronic HBV infection. First, the antigen genes such as PreS2-SU, PreCrC, and so on were expressed. The PreC/C gene with two and four nucleotides mutation was cloned into the shuttle vector pSC11 homologous to the vaccinia virus Ankara strain. The recombinant plasmid was constructed and screened, and the recombinant MVA virus carrying these target genes was screened after 9 passages culture. PCR amplification confirmed that the recombinant virus carried the target gene correctly, and successfully formed a monoclonal in the course of passage. Indirect immunofluorescence identification of the recombinant virus can be recognized by the specific antibody of the expressed antigen. It was proved that the recombinant virus expressed the target antigen correctly and had good antigenicity. DNA vaccine, recombinant virus and murine interleukin-18 mIL-18 plasmid were prepared in large quantities. DNA vaccine was used to immunize rMVA alone. C57BL / 6 mice were immunized with DNA prime/rMVAboost prime/rMVAboost mIL-18. The effects of humoral and cellular immunity were evaluated by ELISA-ELISPOT method. The results showed that PreS2-S was expressed. There was no significant difference in the time and titer of antibody production between the two antigen groups. The production of IFN- 纬 was detected by ELISPOT. All immune groups can cause specific antigen specific cellular immunity rMVA alone immunization group is stronger than DNA vaccine alone immunization group. It was weaker than DNA prime/rMVAboost and DNA prime/rMVAboost mIL-18 group. There was no significant difference between DNA prime/rMVA boost and DNA prime/rMVA boost mIL-18. Studies have shown that the recombinant MVA virus carrying the HBV protective antigen gene can induce specific cellular and humoral immunity against the antigen and combine it with the DNA vaccine expressing the same antigen. The use of DNAprime/rMVA boost can induce a stronger cellular immune response than that of both alone. The results will provide scientific basis for the application of therapeutic HBV vaccine.
【学位授予单位】：中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392
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，本文编号：1441062
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