靶向siRNA体外抑制大鼠肾间质成纤维细胞MAS基因表达的研究

发布时间：2018-01-20 01:45

  本文关键词： 小分子干扰RNA 基因沉默 MAS　出处：《泸州医学院》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：探讨体外直接转染以大鼠肾间质成纤维细胞（NRK-49F）MAS基因为靶标的小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）后，NRK-49F的MAS基因的mRNA表达和蛋白水平是否受到抑制，筛选出高效的siRNA，为进一步研究MAS基因在肾脏疾病中的作用机制提供实验基础。方法：（1）靶向MAS基因的siRNA的设计及合成：通过NCBI检索大鼠MAS基因序列，按照siRNA序列设计原则设计并合成特异性沉默MAS的siRNA3对：siRNA-1（5'-CCUGACCAGAGCUUUCAAATT-3'，5'-UUUGAAAGCUCUGGUCAGGTT-3'）、siRNA-2（5'-GACCAAUCAAAUAUGACAUTT-3'，5'-AUGUCAUAUUUGAUUGGUCTT-3'）、siRNA-3（5'-GCCAUUACUACACAAUCGUTT-3'，5'-ACGAUUGUGUAGUAAUGGCTT-3'）；阴性对照siRNA（siRNA-neg）（5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'）1对。（2）细胞培养：NRK-49F细胞置于DMEM/F12培养基中（含有l0％胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素），在37℃、5%CO2的无菌培养箱中，用0.25%胰酶消化传代，，待细胞悬液内的细胞呈对数生长后，将细胞制成1×105/ml的细胞悬液接种于6孔培养板进行实验。（3）实验分组:①MAS siRNA-1：加入含siRNA序列1的转染混合物（transfection complexes，TC）；②MAS siRNA-2：加入含siRNA序列2的TC；③MAS siRNA-3：加入含siRNA序列3的TC；④阴性对照组（CG）：加入含siRNA阴性序列的TC；⑤空白对照组(NG)：只加入转染试剂；每组设3个复孔。（4）转染：将HiPerFect TransfectionReagent12ul与无血清无双抗培养液混合，配成100ul转染液后，再加入终浓度为10nM的siRNA,两者混匀常温孵育5-10分钟。将转染混合物加入六孔板中，轻轻晃动保证转染混合物分布均匀，恒温箱中孵育，48小时后检测转染效率。（5）基因表达检测：应用反转录酶聚合酶链式反应（rever-setranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR）与蛋白质印迹法（Western blot）检测转染前后MAS的mRNA与蛋白表达的变化。（6）图像处理：采用Quantity One4.4.0软件测定各组灰度值。（7）统计分析：应用软件spss17.0进行统计学分析，通过单因素方差分析检验各组间差异性，P0.05视为有统计学意义。结果：经siRNA干扰后，3条靶向siRNAs均能不同程度的抑制MAS基因的表达。RT-PCR方法检测结果显示siRNA-1组、siRNA-2组及siRNA-3组NRK-49F细胞MAS的mRNA水平与空白对照组相比显著降低(P〈0.05),各组MAS与GAPDH灰度值的比值分别为0.5772±0.0220，0.3380±0.0434，0.6164±0.0767，抑制率分别达到26.89％，57.12％，21.73％，而阴性对照组和空白对照组之间mRNA的表达水平比较则无显著下降。Western blot方法检测结果显示：3条靶向MAS的特异性序列siRNA蛋白表达水平与空白对照组相比显著降低(P〈0.05)，抑制率分别为59.47％，67.81％,50.32％，而阴性对照组和空白对照组之间蛋白的表达水平则无明显差异，与RT-PCR结果基本一致。结论：1.体外转录合成的靶向MAS基因的siRNA可通过阳离子复合物介导瞬时转染至大鼠肾间质成纤维细胞，并发挥基因抑制的作用。2.成功筛选出一组能够高效率特异性沉默大鼠肾间质成纤维细胞MAS基因的siRNA。
[Abstract]:Objective: to investigate the effect of direct transfection of small interfering RNA(small interferingRNA targeting NRK-49 FMAs on rat renal interstitial fibroblasts in vitro. Whether the mRNA expression and protein level of the MAS gene of NRK-49F were inhibited after siRNAs, the highly efficient siRNA was screened out. To provide experimental basis for further study of the mechanism of MAS gene in renal disease. Methods: 1). Design and synthesis of siRNA targeting MAS gene: search rat MAS gene sequence by NCBI. According to the principle of siRNA sequence design, the siRNA3 pair of specific silencing MAS was designed and synthesized. 5 '-CCUGACCAGAGCUUUCAAATT-3'. 5UUGAAAGCUGCUGUCAGGTT-3'siRNA-2UUCAAUAUGACAUTT-3'. 5AUGUUUUUGUGUCTT-3 siRNA-3CCAUUAUACAAUCGUTT-3'. ACGAUGUGUAGUAGCTT-3; Negative control siRNA-negative siRNA-UUCUCCGAACGUGUCGCAUTT-3'. 5ACGUGACACGUGACGGAGAATT-3K1) cells were cultured in DMEM/F12 medium (% NRK-49F). Contains 10% fetal bovine serum. 100 U / ml penicillin and 100 U / ml streptomycin were digested with 0.25% trypsin in a sterile incubator at 37 鈩

本文编号：1446345