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调节性T细胞对NK细胞体外杀伤乳腺癌细胞的影响

发布时间:2018-01-23 09:02

  本文关键词: 调节性T细胞(T-reg) 免疫荧光 激光共聚焦显微镜 MHC链相关基因A(MICA) 转化生长因子β1 荧光定量PCR 出处:《福建医科大学》2008年硕士论文 论文类型:学位论文


【摘要】: 【目的】分析T-reg细胞在乳腺癌病人中的表达情况及其与NK细胞、T细胞亚群之间的关系;探讨体外富集的T-reg对NK细胞杀伤乳腺癌细胞的影响;探讨NKG2D-MICA在NK细胞杀伤乳腺癌中的作用;观察T-reg对NKG2D-MICA作用的影响。 【方法】1、流式细胞术检测乳腺癌患者外周血T-reg的比例;探讨乳腺癌患者TGF-β1的变化。2、应用LDH法检测NK细胞对四种乳腺癌细胞株杀伤率活性。3、ELISA检测培养上清液中IFN-γ和TGF-β1的水平4、荧光定量PCR检测四种乳腺癌细胞株MICA-mRNA的表达。5、应用流式细胞术检测四种乳腺癌细胞株表面及胞内MICA的表达;6、应用免疫组化技术和免疫荧光技术检测四种乳腺癌细胞株MICA的分布情况。7、应用FCM检测NK细胞表面的NKG2D的变化。 【结果】1、乳腺癌病人T-reg的表达:乳腺癌病人和健康志愿者外周血中T-reg占CD4+T细胞总数的百分比分别是(7.5±3.0)%和(5.1±1.5)%,前者高于后者(P0.01)。2、当NK细胞与乳腺癌细胞效靶比为10:1时,对MCF-7、MDA-MB-435s、SKBr-3和MDA-MB-231的杀伤活性分别为(40.7±3.0)%、(15.5±3.1)%、(29.7±1.8)%以及59.1±2.3)%;加入T-reg的数量为1/5的NK细胞时,杀伤活性分别降至(1.9±0.2)%、(5.7±0.4)%、(3.6±2.8)%以及(3.9±0.2)%;加入T-reg的数量为1/10的NK细胞时,杀伤活性分别降至(7.6±1.6)%、(7.3±1.0)%、(6.6±2.5)%以及(19.7±1.1)%。3、ELISA检测NK细胞分泌的IFN-γ结果显示:在无T-reg存在时,NK细胞与MCF-7、MDA-MB-435s、SKBr-3和MDA-MB-231共培养时IFN-γ浓度分别为(221.5±2.6)pg/ml、(264.4±5.5)pg/ml、(754.6±19.0)pg/ml以及(423.0±14.6)pg/ml;加入T-reg的数量为1/5的NK细胞时,IFN-γ浓度分别为(70.7±8.5)pg/ml、(14.6±0.9)pg/ml、(128.3±4.0)pg/ml以及(6.0±1.0)pg/ml;加入T-reg的数量为1/10的NK细胞时,IFN-γ浓度分别为(216.6±4.8)pg/ml、(251.7±2.2)pg/ml、(535.0±8.5)pg/ml以及(52.57±3.4)pg/ml。4、ELISA检测培养上清液中T-reg分泌的TGF-β1结果显示:在无T-reg存在时,NK细胞与MCF-7、MDA-MB-435s、SKBr-3和MDA-MB-231共培养时TGF-β1浓度分别为(13.4±0.2)pg/ml、(11.3±0.8)pg/ml、(62.9±1.3)pg/ml以及(6.2±0.5)pg/ml;加入T-reg的数量为1/5的NK细胞时,TGF-β1浓度分别为(27.2±0.3)ng/ml、(12.2±1.0)ng/ml、(77.6±1.0)ng/ml以及(9.1±0.1)ng/ml;加入T-reg的数量为1/10的NK细胞时,TGF-β1浓度分别为(46.8±1.6)ng/ml、(15.8±0.9)ng/ml、(87.8±2.3)ng/ml以及(10.9±0.6)ng/ml。5、MICA的表达与分布:(1)荧光定量PCR结果显示:MDA-MB-231、SKBr-3、MCF-7和MDA-MB-435s四种细胞株MICAmRNA相对于GAPDH的相对含量分别为5.56×10-3、2.53×10-3、1.68×10-3和5.99×10-5。(2)流式细胞术检测4种乳腺癌细胞株MICA表达,结果显示MDA-MB-231表达量为(61.5±4.5)%、MCF-7为(56.5±4.7)%,而SKBr-3和MDA-MB-435s几乎不表达MICA分子;穿孔后MDA-MB-231和MCF-7这两株细胞株MICA的表达量与穿孔前相比增加不明显,而MDA-MB-435s和SKBr-3这两株细胞株MICA的表达量分别为(26.4±2.5)%和(20.7±1.3)%。(3)免疫组化证实MDA-MB-231细胞和SKBr-3细胞MICA在细胞膜和细胞浆都有表达,MCF-7细胞MICA在细胞浆和核膜都有表达,MDA-MB-435s细胞MICA主要在细胞浆表达;免疫荧光证实MDA-MB-231细胞和SKBr-3细胞MICA在细胞膜和细胞浆都有表达,MCF-7细胞MICA主要表达在细胞膜上,MDA-MB-435s细胞MICA主要在细胞浆表达。NK对不同的乳腺癌细胞株的杀伤结果表明,乳腺癌细胞株MICA表达部位不同,NK细胞对其杀伤率不同。 【结论】T-reg细胞对NK细胞杀伤乳腺癌的作用其机制可能与T-reg分泌的细胞因子TGF-β1有关。MICA在乳腺癌细胞膜上表达越多,NK细胞对该细胞的杀伤率越高。
[Abstract]:Objective To investigate the expression of T - reg cells in breast cancer patients and their relationship with NK cells and T cell subsets , and to investigate the effect of T - reg on NK cells killing breast cancer cells , and to investigate the effect of NKG2D - MICA on NK cells killing breast cancer . Methods : The proportion of peripheral blood T - reg in patients with breast cancer was detected by flow cytometry . The expression of TGF - 尾1 in breast cancer patients was investigated . The expression of MICA - mRNA in four breast cancer cell lines was detected by using LDH method . The distribution of MICA in four breast cancer cell lines was detected by flow cytometry . The percentage of T - reg in peripheral blood of breast cancer patients and healthy volunteers was ( 70.5 卤 3.0 ) % and ( 5.1 卤 1 . 5 ) % , respectively . When NK cells with T - reg was 1 / 5 , the cytotoxicity of NK cells was ( 70.7 卤 8.6 ) % , ( 74.6 卤 0.9 ) pg / ml , ( 64.0 卤 1.0 ) pg / ml and ( 6.0 卤 1.0 ) pg / ml , respectively . The results showed that the concentrations of TGF - 尾1 and MDA - MB - 231 , SKBr - 3 , MCF - 7 and MDA - MB - 435 were ( 62.8 卤 0.3 ) ng / ml , ( 62.9 卤 0.3 ) ng / ml and ( 9.1 卤 0.1 ) ng / ml , respectively . ( 3 ) The expression of MICA of MDA - MB - 231 cells and SKBr - 3 cells was confirmed by immunohistochemistry . The MICA of MCF - 7 cells was expressed in plasma and nuclear membrane . The MICA of MDA - MB - 231 cells and SKBr - 3 cells were mainly expressed in cell membranes and cytoplasm . The results showed that MICA of MDA - MB - 231 cells and SKBr - 3 cells were mainly expressed in cell membranes and cytoplasm . Conclusion The mechanism of killer T - reg cells on killing breast cancer by NK cells may be related to the cytokine TGF - 尾1 secreted by T - reg . The higher the expression of MICA on the cell membrane of breast cancer , the higher the killing rate of NK cells on the cells .

【学位授予单位】:福建医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R392.12;R737.9

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