CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶多克隆抗体的制备及应用

发布时间：2018-01-27 08:09

  本文关键词： 大肠埃希菌 CTX-M-38 超广谱β-内酰胺酶 抗药活性 转化子 多克隆抗体 酶联免疫吸附试验 Western blot 聚合酶链式反应 药敏试验 液体稀释法　出处：《郑州大学》2010年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 广谱抗菌药物,尤其是第三、四代头孢菌素的应用,为临床抗感染治疗作出贡献的同时,也逐步使其面临着严峻的考验。抗菌药物的不合理使用,对病原菌可形成选择压力并筛选出多重耐药菌株；多种基因转移元件的存在及其菌间频繁传递,可致多重耐药性的传播与流行。临床抗感染治疗时常面对无药可用的境地。探究菌株多重耐药机制,涉及产生水解酶与钝化酶、主动外排、药物作用靶位改变以及胞膜渗透性改变等,而最为关键的是产生了超广谱β-内酰胺酶。 自1983年首例产超广谱β-内酰胺酶菌株发现以来,产酶菌株呈世界范围内流行。菌株种类涵盖肠杆菌科、非发酵菌科细菌等；单菌株携带酶型存在地域性分布特征；各型别酶抗药活性间存在一定差异。明确各地区超广谱β-内酰胺酶流行型别抗药活性,早期完成产酶菌株分离、鉴定,对于正确指导临床抗感染治疗,最终降低产酶菌株的产生几率及阻断产酶菌株流行意义重大。 抗菌药物应用习惯差异,造成各地域间超广谱β-内酰胺酶流行型别不同。在我国大部分地区临床分离菌株所产酶型中,CTX-M型超广谱β-内酰胺酶占有相当比例。该型酶由德国学者Bauemfeind首先发现(CTX-M-1),目前已有数十种亚型,其分布地域及宿主菌谱极为广泛。CTX-M型酶水解底物为青霉素类、第一、二代头孢菌素,部分型别可水解头孢吡肟。基于酶蛋白结构构象特征以及药物自身空间位阻差异,CTX-M型酶对头孢噻肟的水解能力显著高于头孢他啶,部分菌株体外试验对头孢他啶显示高度敏感。根据氨基酸序列同源性分析结果,可将CTX-M型超广谱β-内酰胺酶分为5组,各组间氨基酸序列同源性小于90%,组内性大于94%。各组间DNA突变位点可位于编码基因的任一部位。进一步研究表明,尽管CTX-M型酶各亚型间核苷酸序列差异较大,但从酶蛋白结构上看,各突变位点多远离酶活性中心,对于酶蛋白抗药活性影响不大。故各亚型酶均具有CTX-M型酶的共有特性。基于此,明确一种型别CTX-M型酶的耐药谱,对于其他型别抗药活性的抑制具有指导价值。 目前,临床实验室对于产酶菌株的鉴定主要采用三种方式,采用双纸片协同试验初步筛选阳性菌株；采用酶抑制剂增强试验/E-test试验进行确证；采用分子生物学试验进行快速特异性鉴定。前两者均需完成菌株的分离培养,耗时较长,难以满足临床简单快速的要求。后者试验费用较高,且实验软、硬件要求高,一般实验室难以开展。 为了解决上述问题,作者采用双纸片协同及酶抑制剂增强试验筛选、收集46株产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌；采用PCR技术克隆CTX-M型酶表达基因；采用基因重组技术构建CTX-M表达载体并表达；采用液体稀释法完成抗药活性检测。同时,通过免疫小鼠获得超广谱β-内酰胺酶特异性抗体；设计完善酶联免疫吸附试验,建立CTX-M型超广谱β-内酰胺酶的快速鉴定方法。通过上述试验,在明确CTX-M型酶抗药活性的同时,可获得其多克隆抗体,用于快速鉴定,乃至于被动免疫治疗。 本研究包括以下三个部分。 第一部分CTX-M-38型超广谱p-内酰胺酶的表达、定位及其抗药活性研究 方法 1.采用双纸片协同试验及酶抑制剂增强试验,对46株临床分离多重耐药大肠埃希菌进行超广谱β-内酰胺酶筛选与确证。 2.依据CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶核苷酸序列特征,采用DNAstar分析软件,完成特异性PCR扩增引物设计。 3.采用PCR技术,完成CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶全长编码基因的克隆。 4.采用基因重组技术,完成pET-28a-CTX-M-38表达质粒的构建。 5.采用氯化钙转化法,完成pET-28a-CTX-M-38表达质粒在BL21大肠埃希菌中的转化。 6.采用卡那霉素抗性试验,检测BL21-pET-28a-CTX-M-38转化子构建效果。 7．采用双脱氧链终止法对质粒插入片段进行核苷酸序列分析,检测所克隆CTX-M-38型编码基因序列突变状况。 8.采用液体稀释法,检测BL21-pET-28a-CTX-M-38转化子抗药活性。 9.采用K-B法药物敏感试验,检测培养液上清及菌体裂解液中CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶活性,初步进行酶蛋白定位研究。 结果 1.阿莫西林表现耐药,阿莫西林/克拉维酸表现敏感,两者交界处有协同现象,抑菌环直径明显扩大,产超广谱β-内酰胺酶菌株筛选试验阳性。 2.头孢他啶抑菌环直径为8mm,头孢他啶/克拉维酸抑菌环直径为26mm,两者之差显著大于5mm,表明酶抑制剂增强试验阳性,产超广谱β-内酰胺酶菌株确证试验阳性。 3.琼脂糖凝胶电泳显示,PCR扩增阳性产物大小与设计结果相一致。 4.以转化子携带质粒为模板进行PCR扩增,约900bp位置处有目的条带,提示重组质粒构建成功。 5.转化子在含卡那霉素液体培养基中生长良好,表明转化子构建成功。 6.目的基因核苷酸序列与Bla CTX-M-38基因序列比对结果显示,两者在663位点处存在突变(T→A),但氨基酸序列上,两者221位均为丙氨酸,提示此处突变为同义突变。 7.K-B法药敏试验中,滴加上清及菌体裂解液的头孢噻肟纸片均显示耐药,但后者抗药活性较为显著,单纯头孢噻肟纸片显示敏感,提示表达产物主要分布于菌体中。 8.转化子对青霉素类药物包括哌拉西林、氨苄西林显著耐药(MIC32μg/ml),对于头孢唑啉、头孢吡肟、头孢呋辛及头孢克洛MIC值16μg/ml,表现为耐药。头孢噻肟及头孢曲松酶水解活性较强(MIC值均32μg/ml)。头孢他啶MIC值为8μg/ml,表现为体外敏感。转化子对亚胺培南稳定敏感,MIC≤4μg/ml。酶抑制剂复合制剂中,哌拉西林/三唑巴坦敏感(MIC≤16/4μg/ml),而阿莫西林/棒酸、氨苄西林/舒巴坦均表现耐药(MIC32/16μg/ml)。头孢哌酮／舒巴坦MIC为32/16μg/ml,表现为中介。氨曲南表现为敏感(MIC≤8μg/ml)。非内酰胺类抗菌药物中,庆大霉素、四环素、环丙沙星、左氧氟沙星及美满霉素均表现为耐药。 第二部分CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶多克隆抗体的制备 方法 1.采用IPTG诱导BL21-pET-28a-CTX-M-38转化子表达酶蛋白。 2.采用水煮裂解法,完成全菌蛋白提取。 3.采用超声破碎法,完成包涵体蛋白提取。 4.采用SDS-PAGE蛋白电泳技术,检测BL21-pET-28a-CTX-M-38转化子表达产物。 5.采用扩散洗脱法,回收与纯化CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶蛋白。 6.采用传统多克隆抗体制备方法,制备CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶蛋白特异性抗体。 7.采用间接酶联免疫吸附试验,检测所制备多克隆抗体效价。 8.采用辛酸沉淀法,对所制备的多克隆抗体进行纯化。 9.采用Western blot印迹杂交技术,进行多克隆抗体的特异性鉴定。 结果 1. SDS-PAGE蛋白电泳结果显示,BL21-pET-28a-CTX-M-38转化子培养液上清、全菌蛋白、包涵体蛋白泳道,在约30kDa处出现明显蛋白条带,目的酶蛋白分子量大小与设计相同,表明在IPTG诱导作用下,转化子可显著表达酶蛋白。 2. SDS-PAGE蛋白电泳后,各泳道酶蛋白量多少依次为包涵体蛋白、全菌蛋白以及培养液上清,提示转化子表达产物主要存在于包涵体内。 3.间接酶联免疫吸附试验结果显示,多克隆抗体1：1000至1：16000梯度稀释度检测结果均呈阳性。1：32000以后稀释度时无阳性结果出现,表明多克隆抗体效价为1：16000,也表明多克隆抗体制备成功。 4. Western blot印迹杂交技术检测结果显示,不同稀释度的抗体均与同一蛋白条带(约30kDa)反应,此条带与CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶蛋白大小相一致。提示研究中所制备多克隆抗体特异性较好。 第三部分CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶多克隆抗体的应用研究 方法 1.采用梅花形双向琼脂扩散试验,完成CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶蛋白与多克隆抗体反应最适比检测。其中选择4h培养物作为试验抗原浓度,系列抗体滴度采用倍比稀释法制备。 2.采用K-B法药物敏感试验,进行多克隆抗体抑制酶蛋白活性研究。 3.采用改良过碘酸钠法,进行酶标多克隆抗体的制备。 4.采用50%饱和硫酸铵沉淀法,进行酶标多克隆抗体的纯化。 5.依据双抗体夹心法原理,设计制备酶联免疫吸附试验检测试剂盒。 6.针对BL21-pET-28a-CTX-M-38转化子表达产物进行平行试验,检测批内变异,评价实验重复性。 7.与PCR技术进行平行对照试验,完成临床分离产酶菌株检测,评价方法特异性。 8.对27株产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌(不携带CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶)进行检测,评价抗体交叉反应状况。 9.对产CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶菌株不同时间段培养液进行检测,明确超广谱β-内酰胺酶最适检测时间。 结果 1.结果显示,抗体效价为1∶64时,沉淀线出现在两反应孔中间位置,表明抗体与4h培养物反应的最适效价为1∶64。 2.K-B法药敏试验结果显示,抗体组抗菌药物抑菌环直径与对照组比较,p值小于0.01,两者结果有差异。表明CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶蛋白与多克隆抗体结合后,其活性受到一定程度的抑制。 3.多克隆抗体抑制效应表现为阿莫西林、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南等药物的抑菌环直径增大,菌株由耐药转变为敏感或MIC进一步减小。含酶抑制剂复合药物两组结果基本相同。头孢噻肟抑菌环两组结果均无变化。 4.对转化子表达产物30次平行试验结果显示,CV值为1.55%,提示本法批内变异小,具有较好的重复性。 5.146株产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌中,PCR技术检测阳性率为4.11%,本法为7.53%,x2检测可知P0.05,表明两种检测方法检测结果无差异,提示本法具有一定的特异性。 6.交叉反应试验中,27株临床分离产酶菌株中,有1株检测结果为阳性。表明所制备抗体具有交叉反应,实验结果存在假阳性现象。 7.超广谱β-内酰胺酶最适检测时间结果显示,宿主菌在培养2h后,即有酶蛋白产生。4h时酶量显著增多,8h、18h及24h酶蛋白量已超过检测线性范围,故吸光度改变不大。结合检验流程,本研究确定超广谱β-内酰胺酶最适检测时间为菌株培养4h。 结论 1. CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶主要定位于宿主菌包涵体内；转化子具有广泛抗药活性,对部分抗菌药物抗药活性与其他型别存在差异。 2.完成了CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶多克隆抗体的制备、纯化与鉴定,所制备多克隆抗体效价为1∶16000；抗体与CTX-M-38型超广谱β-内酰胺酶蛋白反应特异性较高。 3.多克隆抗体可抑制酶蛋白抗药活性；双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测酶蛋白具有较好的重复性、特异性；临床分离菌株产超广谱β-内酰胺酶最佳检测时间为菌株培养4h。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392
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本文编号：1468029