核糖体展示人源性scFv文库的构建及筛选抗人LBP抗体的局限性分析

发布时间：2018-01-29 10:13

  本文关键词： 脂多糖 脂多糖结合蛋白 核糖体展示 噬菌体展示 单链Fv抗体文库 抗体筛选 原核表达 抗原性　出处：《第三军医大学》2009年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：基因工程抗体是在深入了解抗体基因结构和功能的的基础上,根据研究者的意图,利用DNA重组技术,在基因水平设计生产出新型的抗体,其中单链Fv抗体(singe chain variable fragment,scFv)由于分子量小、组织穿透力强,易于构建表达等特点是目前研究最为广泛的基因工程抗体。噬菌体展示或核糖体展示技术都可以用于高亲和力scFv抗体的筛选。噬菌体展示抗体库是目前发展最成熟、应用最为广泛的基因工程抗体筛选技术,通过噬菌体展示技术使基因工程抗体以融合蛋白的形式展示在噬菌体外壳蛋白gpⅢ或gpⅧ的N端,从而将抗体的基因型和表型连接起来,用固相或液相化抗原与抗体库孵育,经“亲和结合—洗脱—扩增”数个循环使特异性克隆得以富集,因而具有简便、快速和高效的优点。核糖体展示抗体库是一种新型的基因工程抗体体外筛选和分子进化技术,利用体外表达体系以mRNA-核糖体-抗体三元复合物的形式将基因型和表型联系起来用于抗体开发研究。由于所有筛选操作完全在体外进行,库容量远大于噬菌体展示文库,再加上较噬菌体抗体库技术更为简便的建库和筛选方法、可通过引入突变和重组技术来提高被筛选蛋白分子的亲和力等优点使核糖体展示技术成为一种具有潜力的抗体研发技术平台。 细菌脂多糖(LPS)是内毒素的主要组成成分,是严重创伤、烧伤及革兰氏阴性杆菌感染引起的内毒素血症、脓毒症、感染性休克和多器官功能衰竭综合征(MODS)等患者死亡的重要原因之一。虽然近年来在临床治疗技术方面有了较大的进步,但由于其复杂的病理生理过程加大了治疗的难度,死亡率一直居高不下。脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)是一种脂质转移分子,能催化磷脂LPS单体与mCD14和sCD14或磷脂的结合。研究表明,LBP能促进LPS与单核/巨噬细胞膜表面的CD14结合,形成LPS-LBP-CD14复合物激活单核/巨噬细胞,促进炎症的发生、发展。鉴于LBP能显著放大LPS的致病作用,研制亲和力高、特异性强、稳定性好且毒性低的anti-LBP基因工程抗体,以拮抗LBP结合LPS引起的生物学效应,对内毒素血症的防治将具有重要意义。 本研究以重组人LBP蛋白为抗原,利用核糖体展示和噬菌体展示技术筛选anti-LBP基因工程抗体,并希望将筛选得到的scFv改造为更稳定的小分子抗体(如二硫键稳定的Fv抗体(disulfied stabilized Fv,dsFv))用于拮抗LBP分子对炎症反应的放大效应,为内毒素致病性机制及防治手段研究的进一步深入提供理论依据和启示。 本研究共进行了如下三个方面的工作: 1.收集健康献血志愿者的白细胞悬液,分离单个核细胞,抽提其总RNA,逆转录成cDNA,PCR法构建scFv文库,在此基础上通过进一步PCR添加5-端T7启动子、茎环结构、核糖体结合位点以及3-端6×His标签、间隔序列(基因Ⅲ)、茎环结构等改造成适合核糖体展示的大容量天然人源scFv文库。本实验最终共得到纯化的PCR产物10.2μg,按1kb大小双链DNA分子每μg的分子数约为1012计算,本实验获得的核糖体展示scFv文库容量达1013。大容量天然人源核糖体展示scFv文库的成功构建为后续研究中筛选高亲和力抗体及对筛选到的抗体进行改建和进化提供了一种有效的技术平台。 2.以人重组LBP蛋白为抗原包被96孔板,利用构建好的核糖体展示scFv文库筛选anti-LBP基因工程抗体,未能得到阳性克隆;改用噬菌体展示scFv文库共进行了三轮筛选,虽然第三轮筛选共获得384个阳性克隆,但最终经噬菌体ELISA鉴定显示这些克隆表达的噬菌体抗体对人重组LBP蛋白不具备特异性且亲和力不高,说明噬菌体展示技术也未能筛选得到特异性anti-LBP基因工程抗体。分析两种抗体库技术筛选呈阴性结果的主要原因是:⑴核糖体展示技术自身的缺点如在筛选过程中多个核糖体结合到同一条mRNA模板上引起翻译不充分、mRNA-核糖体-scFv复合物的不稳定性和微量mRNA回收困难可能是导致实验未能获得阳性结果的一个重要原因;虽然大容量天然人源核糖体展示scFv文库中没有偏好性,可以筛选到针对各种抗原的抗体,但是天然抗体文库中的抗体亲和力远低于免疫文库,这种差异可能会增加筛选到特定抗体的技术难度。⑵由于噬菌体抗体文库是通过辅助噬菌体感染具有性菌毛的大肠杆菌使基因工程抗体以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面,在筛选环境中有大量的细菌LPS存在,当噬菌体抗体库与LBP孵育时,LBP结合LPS而引起的抗原表位改变可能是导致噬菌体展示scFv未能筛选到针对LBP抗原表位的anti-LBP阳性克隆的关键原因。⑶本实验中抗原包被浓度均低于文献报道的抗原包被浓度,有可能引起抗体筛选困难。在本实验中两种文库筛选技术均未能成功筛选到有效的anti-LBP基因工程抗体克隆,提示不同实验条件下,核糖体展示抗体库和噬菌体展示抗体库技术针对不同的抗原筛选特异性抗体存在一定的局限性。在选择合适的抗体库技术进行基因工程抗体设计和开发研究时要考虑抗原和实验条件等制约因素以及出现阴性筛选结果的可能性。 3.利用原核表达载体表达纯化了N-末端LBP融合蛋白,经Western Blot检测证实大肠杆菌BL21表达的N-末端LBP融合蛋白可以与抗人LBP多抗特异性结合,具有B细胞抗原表位。N-末端LBP融合蛋白的构建和表达方法的建立为克服以人源重组全长LBP蛋白筛选抗体时购买商品化抗原成本高、周期长等不利因素提供了一种替代途径;原核表达的N-末端LBP融合蛋白可用于抗体库筛选时的起始抗原。
[Abstract]:Gene engineering antibody is one of the most widely used genetic engineering antibodies . The phage display or ribosome display technology can be used in the screening of high affinity scFv antibodies . Bacterial lipopolysaccharide ( LPS ) is one of the main components of endotoxin , which is one of the important causes of the death of patients with sepsis , sepsis , septic shock and multiple organ failure syndrome ( MODS ) caused by severe trauma , burn and Gram - negative bacilli infection . In this study , the recombinant human lbp protein was used as the antigen to screen anti - lbp gene engineering antibody by ribosome display and phage display technique , and it was hoped that the scFv modified by the screening was transformed into a more stable small molecule antibody ( such as disulfied stabilized Fv , dsFv ) , which was used to antagonise the amplification effect on the inflammatory response of the bp molecule and provide theoretical basis and inspiration for further study on the mechanism of pathogenic endotoxin and the prevention and control measures . The work of this study was carried out in three areas : 1 . A large capacity natural human scFv library was constructed by adding 5 - terminal T7 promoter , stem ring structure , ribosome binding site and 3 - terminal 6 脳 His tag , spacer sequence ( gene 鈪，

本文编号：1473170