小鼠真皮间充质干细胞皮损内注射对硬皮病小鼠模型局部皮损的改变和结缔组织生长因子含量的影响

发布时间：2018-02-01 01:55

  本文关键词： 真皮 间充质干细胞 硬皮病 厚度 结缔组织生长因子　出处：《河北医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：硬皮病（scleroderma，SD）是以弥漫性或局限性的皮肤和内脏器官纤维化、硬化性为特征的结缔组织病，其发病率占到结缔组织疾病中的第三位，并呈逐年增加的趋势。硬皮病发病隐匿且机制复杂未明，难以诊断和治疗，长期以来成活率低。目前国内外的治疗主要是针对免疫系统、血管系统及胶原纤维合成的改变与异常，但治疗效果并不理想。因此，寻求更为安全、有效的治理方法就成为当务之急。近年来，随着人们对干细胞研究的进一步发展，其在治疗其他疾病方面取得明显成效。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)来源丰富，并且具有自我更新及多向分化的能力，同时还具有低免疫原性的特点。真皮间充质干细胞(dermalmesenchymal stem cells,DMSCs），易于提取，并具有干细胞的一般特性，使其成为治疗硬皮病的一个新选择。结缔组织生长因子(connective tissuegrowth factor,CTGF）在硬皮病的发生和发展中起到致纤维化和维持纤维化的作用。本研究通过建立具有局部皮肤损害的硬皮病小鼠模型，通过皮下注射小鼠真皮间充质干细胞(mouse dermis-derived mesenchymal stemcells,mdMSCs)来观察其对局部皮损的改变和结缔组织生长因子含量的影响，为探讨临床应用真皮间充质干细胞治疗硬皮病提供实验依据。 方法： 1以组织消化法分离、纯化mdMSCs，并进行常规传代培养。 2观察第3代mdMSCs的形态，使用流式细胞仪检测细胞的生长周期和表面标记。 3使用PKH26进行mdMSCs标记。 4硬皮病小鼠模型的制备：将24只6周龄雌性BALB/C小鼠随机分为A组(11只)、B组(11只)、C组（2只）。A、B组连续背部皮下注射500μg/ml的博来霉素，每日1次，每次0.1ml，C组注射PBS，共3周，用颈椎脱臼法随机处死A、B组中的2只造模小鼠和C组小鼠，取小鼠背部注射区皮肤组织行HE染色、苦味酸-酸性品红染色和CTGF免疫组织化学染色，证实造模成功。 5向A组硬皮病小鼠模型局部皮损处皮下注射已标记的mdMSCs，B组注射PBS，让小鼠自由获取食水，观察并记录小鼠注射区皮肤弹性、外观等大体变化。 6三周后将A、B组小鼠全部颈椎脱臼法处死，，切取背部注射区皮肤，制作组织病理切片，测定各小鼠真皮的厚度及皮内CTGF的含量。荧光显微镜下观察荧光阳性的细胞在小鼠局部皮损内的分布。 7运用SPSS统计学软件对数据进行统计分析。 结果： 1以组织消化分离、纯化得到的细胞，可传代逐步得到呈多角形、扯布状形态的细胞。 2流式细胞仪检测mdMSCs细胞周期，通过检测细胞内的DNA含量发现，大多数细胞处于静止期(G1期：83.02%)，只有少数处于分裂期(S/G2期：16.98%，G1/G2期：1.95%)，表面标记显示CD29+、CD44+，双阳性细胞约为90%，结合观察所得细胞的形态证实分离纯化培养的细胞为mdMSCs。 3荧光显微镜下观察PKH26标记后的mdMSCs，可见细胞胞膜呈均匀的红色荧光，且子代也带有荧光，PKH26标记不影响细胞活性及增殖能力。 4A、B组小鼠在连续3周皮下注射博来霉素成功诱导出具有局部皮肤损害的硬皮病小鼠模型，并且均未死亡及未见明显全身不良反应。 5A组小鼠经真皮间充质干细胞局部皮损处皮下1哦，注射3周后，荧光显微镜下观察可见已标记的干细胞分布于真皮层和皮下组织，小鼠皮肤真皮的厚度较B组小鼠皮肤真皮的厚度明显变薄（P值为0.0240.05），CTGF含量在两组间无明显差异(P值为0.1760.05)。 结论： 1BLM500μg/ml皮下注射SPF级BALB/C小鼠，每日1次，每次0.1ml，连续3周可成功建立具有局部皮肤损害的硬皮病小鼠模型。 2mdMSCs局部皮损处皮下注射可有效改善硬皮病小鼠模型局部皮损的硬化情况和真皮厚度。 3mdMSCs局部皮损处皮下注射对硬皮病小鼠模型局部皮损的影响可能并不是单一通过调控CTGF的表达实现的。
[Abstract]:Objective: scleroderma (scleroderma, SD) is a diffuse or localized skin and visceral organ fibrosis, sclerosis of connective tissue disease characterized by the incidence of a disease to connective tissue disease in third, and showed a rising trend. The incidence of occult and scleroderma complicated mechanism is unknown, it is difficult to diagnosis and treatment. Long term survival rate is low. The current treatment at home and abroad is mainly aimed at the change of the immune system, vascular system and collagen synthesis and abnormal, but the treatment effect is not ideal. Therefore, looking for a safe and effective treatment method has become a pressing matter of the moment. In recent years, with the further development of stem cell research, the obvious effect in the treatment of other diseases. Mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cells, MSCs) rich source, and has the ability of self-renewal and multi-directional differentiation, with low immunogenicity The characteristics of dermal mesenchymal stem cells (dermalmesenchymal stem cells, DMSCs), easy to extract, and has general characteristics of stem cells, make it become a new choice for the treatment of scleroderma. Connective tissue growth factor (connective tissuegrowth, factor, CTGF) plays a role in fibrosis and fibrosis in the occurrence and development of maintenance scleroderma disease. Scleroderma mouse model with local skin damage in this paper, by subcutaneous injection of mouse dermis derived mesenchymal stem cells (mouse dermis-derived mesenchymal stemcells, mdMSCs) to observe the influence of the changes of local skin and connective tissue growth factor in the clinical application of dermal mesenchymal stem cells to provide experimental basis for the treatment of scleroderma.
Method锛

本文编号：1480597