CD34抗体表面修饰去细胞光氧化牛颈静脉再内皮化的研究

发布时间：2018-02-02 22:54

本文关键词：去细胞光氧化牛颈静脉(BJV) 鼠抗人CD34抗体 FITC标记羊抗鼠IgG SANPAH 牛颈静脉(BJVC) CD34抗体人脐静脉内皮细胞株(HUVEC CRL-2480) 内皮化体外牛颈静脉(BJVC) CD34抗体人脐静脉内皮细胞株(HUVEC CRL-2480) 内　出处：《中南大学》2008年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 第一章牛颈静脉基质材料的制备及表面CD34抗体修饰的研究目的:通过按不同摩尔比,用光化学交联剂SANPAH将不同浓度鼠抗人CD34抗体接枝于经过去细胞和光氧化后的牛颈静脉(BJV)表面的初步研究,明确接枝鼠抗人CD34抗体的最佳浓度和与SANPAH的最佳反应摩尔比,探讨CD34抗体光化学偶联法修饰去细胞光氧化牛颈静脉基质的方法。方法:按4个不同摩尔比,SANPAH和4个不同浓度鼠抗人CD34抗体进行反应后,经紫外线照射光化学接枝于经过去细胞和光氧化后的BJV上,各组进行快速冰冻切片,滴加FITC标记的羊抗鼠IgG,然后在荧光显微镜下照相,用Image-pro plus 5.0对图像进行分析,比较不同摩尔比和浓度反应、结合的荧光效果,从而初步推断出最佳反应和结合的摩尔比和浓度。结果:随着鼠抗人CD34抗体浓度的升高,荧光累积光密度、平均光密度,整体上是越来越强,但是当浓度高于0.665×10~(-2)mM时,荧光差别不是很明显;当鼠抗人CD34抗体和SANPAH的反应摩尔比为1:20时,荧光最强。结论:最佳的鼠抗人CD34抗体和SANPAH反映接枝的浓度是0.665×10~(-2)mM,最佳的摩尔比是1:20。第二章CD34抗体表面修饰去细胞光氧化牛颈静脉体外再内皮化研究目的:探讨鼠抗人CD34抗体表面修饰后的去细胞光氧化牛颈静脉体外促进再内皮化的情况。方法:牛颈静脉经过去细胞和光氧化交联后,裁成与24孔培养板孔径相同大小的、直径1.6cm的血管片,用光化学偶联剂SANPAH采用第一章的方法将CD34抗体接枝到牛颈静脉血管片上,以未接枝CD34抗体的作为空白对照。在其上面种植人脐静脉内皮细胞株(HUVEC,CRL-2480)5×10~5/ml,静态培养,取第1,3,5,7日标本,一半血管片表面细胞消化并记数,另一半标本切片HE染色,对比CD34抗体接枝后和空白对照组血管片表面细胞粘附数目和HE的染色结果,以探讨接枝CD34抗体体外能否促进细胞粘附和生长。结果:(1)细胞计数:细胞培养第1、3、5、7日,CD34抗体组细胞数目均多于对照组(p＜0.05),(2)标本石蜡包埋后切片HE染色结果:第1天各组血管片表面细胞排列密集,紊乱,未完全铺开;第3天,对照组血管表面细胞数量减少明显,有断裂出现;CD34抗体组细胞连接成片,呈单层排布;第5,7日这种现象更明显,第7日两组细胞数与本组第5日无明显差异。结论:CD34抗体表面修饰的牛颈静脉,体外能促进内皮细胞的粘附与生长。第三章CD34抗体表面修饰去细胞光氧化牛颈静脉体内再内皮化研究目的:探讨鼠抗人CD34抗体表面修饰后的去细胞光氧化牛颈静脉体内促进再内皮化的情况。方法:24只犬随机分入处理组和对照组,将CD34抗体表面修饰和未修饰的血管植入犬右室流出道与肺动脉主干之间,采用连续缝合的方式进行旁路重建,术后两组均给予阿托伐他汀10mg/kg%q天和1.25mg/天剂量的华法林喂养,分别于术后10天、20天、1月、2月取出血管,标本进行石蜡包埋HE染色、Ⅷ因子免疫组织化学、透射电镜和扫描电镜检测,取普通显微镜40倍下的HE染色的血管片标本照相,用Image-pro plus 5.0对图像进行测量内膜厚度,计算平均值,两组间进行比较;取普通显微镜40倍Ⅷ因子免疫组织化学血管标本照相,Image-pro plus 5.0对图像进行细胞计数,评价内皮化程度。结果:(1)组织大体观结果:间植血管质软,周围粘连较轻,颜色变白,亚甲兰的蓝色已完全消失。剖开见血管表面光滑,瓣膜组织菲薄,开闭好,无血栓,其上附着一薄层增厚组织,薄而透明,为新生内膜组织。 (2)HE染色结果:经过去细胞光氧化交联的BJVC植入体内,细胞浸润受到抑制,浸润全层首先在血管吻合区域发生,术后10天两组中间区域均未能浸润全层,只是在小部分个别区域全层BJVC有细胞相连;CD34抗体组在新生内膜中有更多的细胞,而对照组则主要还是纤维素等不定型成分。新生内膜在吻合区域薄,中间较厚,剔除新生内膜后的HE切片显示:术后10天,CD34抗体组BJVC表面有细胞粘附,对照组几乎没有细胞;CD34抗体组术后20天即能在内膜面看到内皮样细胞覆盖,术后1个月完整覆盖补片,对照组则需要术后2个月才能看到内膜面较多的细胞覆盖,Image-pro plus 5.0细胞计数抗体组较对照组多,内皮化程度高,统计学有显著差异。 (3)Ⅷ因子染色结果:CD34抗体表面修饰后的血管片植入大鼠体内10天后Ⅷ因子染色即呈阳性,而且新生内膜中已经形成新生微血管,20天后阳性更强;对照组20天后内膜面只有很少的细胞,Ⅷ因子染色是阴性,2个月后虽然内膜面虽有较多的细胞,但是Ⅷ因子染色仍是阴性。 (4)扫描电镜结果:CD34抗体组术后10天内膜面可见较多的上皮样细胞顺血流方向排列,但是细胞之间有间距,术后20天内膜面附着一层排列致密、整齐的内皮细胞,细胞间可见形成的牢固连接;对照组术后20天内膜面仍是增厚的纤维素样物质,下面似有细胞突起,可能为平滑肌或成纤维细胞,表面无内皮样细胞覆盖,只是粘附一些大分子物质和散在的一些小细胞。 (5)内膜厚度的比较:术后第10天,CD34抗体组新生内膜较对照组厚,但是没有统计学意义(P＞0.05),随后的20天、1个月、2个月CD34抗体组新生内膜均较对照组薄,而且有统计学意义(P＜0.01)。两组新生内膜总体上说随着时间的延长,厚度越来越大,术后20天时达到高峰,1个月即开始下降,CD34抗体组术后20天新生内膜厚度有波折,其在2个月时下降到术后10天的水平,而对照组厚度值仍然较大。结论:CD34抗体表面修饰的牛颈静脉,体内能快速达到内皮化的效果,虽然仍然伴有内膜的增生,但是新生内膜的厚度显著薄于未经CD34抗体修饰的牛颈静脉。
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【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

【参考文献】