单纯疱疹病毒II型LAT基因开放读码框1抗细胞凋亡作用的研究

发布时间：2018-02-03 00:27

本文关键词： Vero细胞放线菌素D 抗凋亡作用单纯疱疹病毒2型潜伏相关转录体开放读码框1　出处：《华南理工大学》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：单纯疱疹病毒Ⅱ型（Herpes Simplex Virus Ⅱ,HSV-2）具有易感染，容易传播，难治愈的特点。它主要引起生殖器疱疹（genital herpes,GH）。初次感染HSV-2后，病毒会终身潜伏在人体的骶尾神经节中。当受到体内外各种非特异性刺激时，病毒会被激活，造成复发感染，并出现相应的临床症状。目前疱疹病毒潜伏及再激活的机制一直未明，是临床上根治生殖器疱疹的难点所在。潜伏相关转录体是（Latency associated transcript,LAT）HSV-2在潜伏感染期间唯一大量表达的基因组转录产物。国外大量的研究表明，潜伏相关转录体在单纯疱疹病毒潜伏及再激活过程中起着至关重要的作用。目前有关LAT的作用假说很多，但具体是哪一种作用机制尚不明确。HSV-2起主要作用的LAT包含3个开放读码框（Open Reading Frame，ORF）。有研究表明单纯疱疹病毒LAT可以通过读码框编码蛋白的抗凋亡作用抑制宿主细胞的凋亡，维持病毒的潜伏感染状态。为此，本研究以HSV-2333基因组为模板PCR扩增HSV-2LAT ORF1，构建重组真核表达载体pEGFP-ORF1。借助于xfect转染试剂盒，转染重组子，研究其在Vero细胞中的表达及其抗凋亡作用。首先根据gene bank中的LAT ORFs序列设计引物，以HSV-2333基因组为模板PCR扩增HSV-2LAT ORF1片段。PCR产物纯化后同pEGFP-C2经EcoRI、KpnI双酶切后，用T4-ligase连接，转化进E.coli Top10感受态细胞，kan+抗性筛选阳性菌落，通过菌落PCR，双酶切和测序对所筛选的重组质粒进行鉴定。重组质粒转染入Vero细胞，24h后在荧光显微镜下观察HSV-2潜伏相关转录体LAT开放读码框ORF1融合绿色荧光蛋白的表达情况。RT-PCR确认ORF1mRNA在Vero细胞中成功转录。转染48h后在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的分布情况，显微镜下可见重组质粒pEGFP-ORF1表达的绿色荧光主要集中在细胞核，大多数为圆形，形态规则，分布均匀。而空质粒pEGFP-C2表达的绿色荧光在细胞核和细胞质中都有分布，且不规则，与重组质粒组相比较，荧光强度较弱。本研究用凋亡诱导剂放线菌素D(ActD)诱导各组细胞凋亡，荧光显微镜及Hochest3328荧光染色观察凋亡诱导后各组细胞的形态特点。Gimesa染色观察各组细胞细胞核的变化；发现转染pEGFP-ORF1一组的细胞形态正常，与正常对照组细胞无差异。MTT结果表明转染了重组质粒pEGFP-ORF1的Vero细胞经放线菌素D凋亡诱导后Vero细胞活性与未经任何处理的正常对照组相比，，差异无统计学意义(P0.05)，但高于放线菌素D诱导凋亡的Vero细胞组及与转染空质粒pEGFP-C2且放线菌素D诱导凋亡的Vero细胞组，差异具有统计学意义(P0.05)。流式结果表明，转染重组质粒pEGFP-ORF1且经放线菌素D诱导凋亡组与正常对照组凋亡率差异无统计学意义(P0.05),而显著低于放线菌素D诱导凋亡组和转染空质粒pEGFP-C2且经放线菌素D诱导凋亡组，差异显著(P0.05)；caspase-3活性检测表明转染重组质粒的Vero细胞组caspase-3活性与正常对照组无显著差异，而明显低于空质粒组差异有统计学意义综述以上研究结果表明，HSV-2LAT基因ORF1片段具有抗放线菌素D在Vero细胞中诱导的细胞凋亡的功能。本实验研究为探究有关HSV-2LAT介导的病毒的潜伏和复发的机制打下一定基础。
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【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373

【参考文献】