TGF-β3通过激活Myocardin诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化
本文关键词： 骨髓间充质干细胞 心肌素 平滑肌细胞 转化生长因子β3 出处：《天津科技大学》2010年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：间充质干细胞(MSCs)作为组织工程中最具优势的种子细胞,具有强的自我更新能力和多向分化潜能。本论文以骨髓间充质干细胞(BMMSCs)作为研究细胞分化信号转导的对象,发现转录因子心肌素(myocardin)在转化生长因子β3(TGF-β3)诱导的骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞(SMCs)分化中具有重要作用,并且深入研究了TGF-β3和myocardin诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的分子机制。我们对诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞的定向分化及其分子机制的研究,为临床提供种子细胞治疗血管损伤修复奠定了实验基础。 TGF-β3是一种多功能的生物活性调节因子,广泛调控细胞增殖与分化等过程。使用TGF-p3处理骨髓间充质干细胞,RT-PCR和免疫细胞化学结果显示平滑肌细胞标志物,包括平滑肌肌浆球蛋白重链(SMMHC)x SM22α、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),都显著增高。这些结果说明TGF-β3可以诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化。 Myocardin是血清反应因子(SRF)的辅助激活转录因子,它在平滑肌细胞分化中起着重要的作用。利用RT-PCR和Western blotting的方法检测了转录因子myocardin在此分化过程中的表达情况,结果发现转录因子myocardin的mRNA和蛋白水平上调。同时将myocardin转染至骨髓间充质干细胞中,RT-PCR结果显示SMMHC、SM22α、 a-SMA都显著增高,荧光素酶活性实验证明在间充质干细胞中1myocardin可以激活SM22a启动子。进一步利用myocardin缺失转录激活域的真核表达质粒myocardinATAD竞争性抑制内源myocardin的功能,发现myocardin功能缺失后,TGF-p3不能诱导骨髓间充质细胞分化。这些结果说明1myocardin可以诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化,TGF-β3信号通路依赖或部分依赖于myocardin。 为深入研究TGF-β3和myocardin诱导的骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的分子机制,利用RT-PCR方法检测TGF-β3通路的下游信号分子Smad2/3的mRNA水平,结果Smad2/3的mRNA水平显著升高,并且在TGF-β3刺激30分钟时Smad2/3迅速地发生磷酸化。荧光素酶活性实验进一步证明,Smad2能够与myocardin协同增加SM22α的启动子活性,而Smad3不具备这种能力。在缺失内源myocardin功能的骨髓间充质干细胞中,TGF-β3和其相关转录因子Smad2失去了对平滑肌分化标志物的上调功能。细胞周期抑制因子Rb、p16、 p21参与myocardin和TGF-β3诱导的骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化过程。
[Abstract]:Mesenchymal stem cells (MSCs), as the most advantageous seed cells in tissue engineering, have strong self-renewal ability and multi-differentiation potential. In this paper, bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSCs) were used to study the signal transduction of cell differentiation. It was found that myocardinin plays an important role in the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into smooth muscle cells induced by transforming growth factor 尾 3 (TGF- 尾 3). The molecular mechanism of differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into smooth muscle cells induced by TGF- 尾 3 and myocardin was studied. It lays an experimental foundation for the treatment of vascular injury by seed cells. TGF- 尾 3 is a multifunctional biological activity regulating factor, which widely regulates cell proliferation and differentiation. RT-PCR and immunocytochemistry results of TGF-p3 treatment of bone marrow mesenchymal stem cells show smooth muscle cell markers. These results indicated that TGF- 尾 3 could induce the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into smooth muscle cells. Myocardin is an auxiliary activated transcription factor of serum response factor (Myocardin), which plays an important role in the differentiation of smooth muscle cells. The expression of myocardin in the process of differentiation was detected by RT-PCR and Western blotting. The results showed that the levels of mRNA and protein of transcription factor myocardin were up-regulated, and myocardin was transfected into bone marrow mesenchymal stem cells. The results of RT-PCR showed that both SM22 伪 and a-SMA of SMMHC-SM22 伪 and a-SMA were significantly increased. Luciferase activity assay showed that 1 myocardin could activate the SM22a promoter in mesenchymal stem cells. Furthermore, myocardinATAD, an eukaryotic expression plasmid with myocardin deletion transcriptional activation domain, could competitively inhibit the function of endogenous myocardin. It was found that TGF-p3 could not induce the differentiation of bone marrow mesenchymal cells after myocardin function loss. These results suggested that 1 myocardin could induce the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into smooth muscle cells. TGF- 尾 3 signaling pathway was dependent or partly dependent on myocardinin. In order to study the molecular mechanism of the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into smooth muscle cells induced by TGF- 尾 3 and myocardin, the mRNA level of downstream signal molecule Smad2/3 in TGF- 尾 3 pathway was detected by RT-PCR method. The mRNA level of Smad2/3 was significantly increased. Moreover, the phosphorylation of Smad2/3 occurred rapidly after 30 minutes of TGF- 尾 3 stimulation. Luciferase activity further demonstrated that Smad2 could increase the promoter activity of SM22 伪 in coordination with myocardin. TGF- 尾 3 and its related transcription factor Smad2 lost the up-regulation of smooth muscle differentiation markers in bone marrow mesenchymal stem cells lacking endogenous myocardin function. TGF- 尾 3 induced differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into smooth muscle cells.
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329
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，本文编号：1499576
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