蓖麻毒素拮抗分子的研究

发布时间：2018-02-11 16:06

本文关键词： 蓖麻毒素蓖麻毒素A链中和抗体计算机辅助分子设计亲和力提高虚拟筛选小分子拮抗化合物　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2009年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 目的:蓖麻毒素(ricin)是从植物蓖麻种子中分离得到的一种Ⅱ型核糖体失活蛋白,其A链(RTA)为效应链,通过B链(RTB)几乎可以和所有的真核细胞结合。一分子ricin进入细胞内,在一分钟内就可以使1777个核糖体失活,从而很快杀死整个细胞。ricin制成粉剂、水溶剂后性质稳定,经呼吸道吸入、消化道摄入和肌肉注射等均可致人中毒,以气溶胶或肌肉注射对人的致死剂量估计为5~10μg/kg体重,其毒性是有机磷神经毒剂VX的385倍,是氰化物的6000倍。ricin生产原料蓖麻籽来源广泛,提取制备方法简便,很容易被恐怖分子利用,因此研究ricin及RTA的拮抗剂具有重要的现实意义。内容、方法:本室通过常规免疫Balb/c小鼠,获得了多株具有自主知识产权的抗ricin中和抗体,体外和体内实验均显示出一定的中和活性。本文在合理评价鼠源抗体功能的基础上,对具有高中和活性的鼠源功能抗体进行人源化改造获得嵌合抗体;借助本室建立的“基于抗原—抗体相互作用结构信息设计新型结构抗体分子”技术平台,利用轻重链CDR区定点突变对嵌合抗体进行体外亲和力成熟改造;基于RTA及RTA-底物类似物复合物的晶体结构,ricin与功能抗体4C13_Fv作用复合物空间构象,利用计算机虚拟筛选方法,获得新型拮抗RTA先导化合物。研究内容及方法概括如下: 1、对具有中和活性的鼠源功能抗体进行人源化改造在鉴定3株小鼠抗ricin单克隆抗体的中和活性的基础上,选择中和活性最高的鼠源抗体4C13作为人源化改造的亲本抗体,钓取杂交瘤细胞轻重链可变区基因,构建嵌合抗体表达载体,瞬时共转染293T细胞,运用ELISA、Western blot及细胞毒实验鉴定表达抗体的抗原识别特异性、中和活性,并测定其相对亲和常数; 2、计算机辅助设计提高嵌合抗体C4C13亲和力与评价通过计算机辅助分子模拟对抗体4C13可变区Fv三维结构进行合理搭建,并通过力学优化获得其稳定的三维构象。利用已解析的ricin晶体结构,通过分子对接获得4C13_Fv片段与ricin相互作用的复合物模型,经计算机图形学技术、计算生物学相关理论,预测抗原抗体相互识别区域、关键氨基酸残基及作用模式;同时依据相互作用自由能、分子间氢键、疏水作用等,设计嵌合抗体C4C13突变体并对其亲和力进行理论预测。根据突变体序列设计引物,利用重叠PCR技术扩增目的基因,构建相应的突变体真核表达载体进行瞬时表达,通过ELISA、Western Blot、竞争结合实验等手段对表达抗体的抗原识别特异性及亲和力大小进行相应的检测。 3、基于RTA及RTA-底物类似物复合物晶体结构虚拟筛选小分子拮抗化合物根据RTA的晶体结构、RTA与其底物类似物的晶体结构、ricin与4C13_Fv作用复合物结构,结合RTA突变体实验结果,合理确定RTA的脱嘌呤功能区域。通过计算机图形学技术,借助距离几何学、分子间氢键形成理论,利用确定的RTA功能活性区域结构特征,合理确定药效团特征,进而形成与RTA功能域作用位点模式,通过ACD化合物数据库进行虚拟筛选。利用分子对接对筛选获得的化合物进行理论评估,确定能够成为RTA抑制剂的先导化合物。选择pET32a载体原核表达RTA,并检测其生物学活性;在分子水平选用兔网织红细胞裂解液蛋白合成体系实验探讨化合物抑制RTA的毒性作用;在细胞水平选择对RTA敏感的小鼠骨髓瘤细胞—SP2/0细胞分析化合物拮抗RTA的生物学功能,以此评估筛选先导化合物的活性。结果:1、对具有中和活性的鼠源功能抗体进行人源化改造:以小鼠骨髓瘤细胞SP2/0建立ricin细胞毒模型,鉴定并选择中和活性最高的鼠源抗体4C13作为人源化改造的亲本抗体;钓取轻重链可变区基因,构建了真核表达载体pCMV_4C13_VH和pCMV_4C13_VL,实现了嵌合抗体在真核细胞中的瞬时表达,生物学实验显示,C4C13保持了亲本抗体的识别特异性和中和活性。 2、计算机辅助设计提高嵌合抗体C4C13亲和力与评价:利用分子对接构建稳定的4C13_Fv/ricin相互作用的复合物模型,预测抗原—抗体作用模式并确定影响抗体亲和力的三个关键氨基酸残基,进一步设计了突变体(M1) VH-N102F,VH-W103Y,(M2)VH-W103Y;(M3) VL-R90G,并对其亲和力进行理论预测;通过ELISA、Western Blot、竞争结合实验等手段对表达抗体的抗原识别特异性及亲和力大小进行相应的检测,亲和力高低依次为:M1M2C4C13M3,实验结果与理论预测结果一致,提示获得的4C13_Fv/ricin作用复合物结构是合理的。 3、基于RTA、RTA-底物类似物复合物晶体结构及4C13_Fv/ricin相互作用的复合物模型虚拟筛选小分子拮抗化合物:通过虚拟筛选ACD化合物数据库获得4种小分子化合物,原核表达的rRTA显示了良好的生物学活性,在无细胞蛋白合成体系实验中,四个化合物与阳性对照都表现出一定的拮抗RTA的活性,细胞毒实验中,化合物3025对rRTA显示出较好的浓度依赖的抑制效应。结论:本研究成功构建了嵌合抗蓖麻毒素中和抗体C4C13,并保持了亲本抗体的识别特异性和中和活性,其鼠源序列下降了70%,有效降低了在临床应用中可能产生的人抗鼠抗体(HAMA)反应,提高了治疗的有效性;借助“基于抗原—抗体相互作用结构信息设计新型结构抗体分子”技术平台,成功搭建了ricin与功能抗体4C13 _Fv作用复合物模型,并对嵌合抗体进行体外亲和力成熟改造;利用计算机虚拟筛选方法获得RTA拮抗先导化合物,生物学实验证实,获得的先导化合物能够阻断RTA的生物学功能,为进一步研发RTA小分子拮抗剂奠定了基础。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【参考文献】