合体滋养细胞微绒毛膜制备子痫前期动物模型的研究

发布时间：2018-02-11 17:34

本文关键词： STBM 子痫前期 C57BL/6小鼠动物模型胎盘　出处：《第三军医大学》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景和目的：子痫前期（pre-eclampsia,PE）是妊娠期特有的疾病，发病率大约占妊娠中的3%-8%，主要表现为高血压、蛋白尿、凝血功能障碍等，可伴有心、脑、肾、肝等多脏器功能的损害，是产科常见的严重影响孕产妇及围产儿健康的疾病之一。由于PE的发病机制不明，无法在PE发病的早期通过干预手段精确调节滋养细胞的侵袭行为来对PE进行治疗，因此，阻断PE发病后的病理生理过程，对保障母婴安全更有意义。子痫前期的病因研究大约已经历半个多世纪，用于发病机制研究的动物模型各异，目前PE的动物模型有子宫胎盘缺血缺氧、药物诱导血管收缩、免疫相关、寒冷刺激、胎盘广泛性微血栓模拟胎盘缺血缺氧状态等，这些模型通过不同的机制在发病的不同环节复制了PE发病的病理生理过程，研究靶点各异，因此可应用于不同的研究需要，但能全面模拟PE的临床及病理生理表现，反应胎盘局部状况和母体多器官功能损害的经典模型尚欠缺。 PE孕妇在胎盘娩出后各种临床症状迅速消失，说明胎盘可能是诱发PE发生的不良因子的来源。晚孕时胎盘与母体血液直接接触的部分全部由合体滋养细胞（Syncytiotrophoblsat,ST）覆盖，ST表面被覆微绒毛，增加与母血物质交换的面积。随着滋养细胞的激活或凋亡，其微绒毛膜会掉落到母体血循环中形成囊泡样颗粒，称为合体滋养细胞微绒毛膜（syncytiotrophoblast microvillous membrane，STBM）。研究所见来自于胎盘的不良因子甚多，其中STBM被认为是重要的一种，研究表明STBM在正常孕妇体内少量存在，而在PE孕妇体内含量上升，但其脱落的机制尚不清楚。大量的体外研究均证实STBM与PE的发病密切相关，但基于这些体外研究所推测的各种发病机制在体内是否存在尚无法证实，PE发病时STBM在体内主要的致病机制及其对主要脏器、各功能系统的影响尚不明确，其在正常妊娠时以及PE发病时的体内分布、代谢特点、主要作用靶器官亦不明了。然而，由于伦理及孕产妇的特殊性，无法在人群中进行实验，而又由于免疫等条件的限制，来源于人的STBM无法使用到动物实验中。使STBM应用到动物实验中受到了免疫学的限制。如能成功建立一种以STBM为研究靶点的PE动物模型，就有可能观察到STBM在体内的致病环节及其对主要脏器、各功能系统的影响，有可能明确其在正常妊娠及PE发病时的体内分布、代谢特点、主要作用靶器官，并阐明其在体内致PE发病的致病环节，为进一步阐明PE的病理生理过程，发掘新的治疗方法及预警指标提供新的研究思路和直接的实验支持，为查找PE的致病环节提供线索，且对该领域后续的研究具有重要的意义。本研究旨在通过模拟PE发病时体内的高浓度STBM状态，建立一种基于STBM的PE动物模型，为进一步阐明PE的病理生理过程，发掘新的治疗方法提供直接的实验支持。材料和方法： 1.研究对象及分组选择健康2月龄C57BL/6小鼠处鼠，按雌雄1:1于每日18:00合笼，于第二日清晨08:00观察雌鼠阴道内阴道栓，如发现乳白色阴道栓则视为已交配，计为妊娠第0天，随机选择成功受孕的小鼠20只，再随机分为两组，标记为STBM孕鼠组（PS组）、PBS孕鼠组（PP组），余下受孕小鼠留待制备STBM制剂时使用。另取20只2月龄C57小鼠雌鼠处鼠，随机分为两组，标记为STBM处鼠组（NS组）、PBS处鼠组（NP组）。 2.小鼠STBM制剂的制备于妊娠第18天将留待制备STBM制剂的孕鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后于无菌条件下剖宫取出胎盘，冰PBS洗去胎盘残留血液，无菌纱布吸干表面水分后用无菌眼科剪将胎盘剪为约1mm3组织块，称取2g胎盘组织放入100mlNaCl溶液中（0.15M，1%青-链霉素），4℃振荡过夜，取上清离心：1000g，10min，弃沉淀；10000g，10min，弃沉淀；70000g，90min，弃上清，得到STBM富集沉淀。以4℃的PBS洗涤沉淀，并以4℃的PBS（5%蔗糖）重悬，保存于-20℃备用。 3.STBM的鉴定及浓度的测定应用Improved-lowry蛋白定量试剂盒测定STBM的蛋白浓度，小鼠组织多肽抗原ELISA试剂盒测定小鼠STBM制剂中组织多肽抗原（tissue polypeptide antigen，TPA）含量，按照试剂盒说明说严格进行实验操作。 4.扫描电子显微镜观察STBM的形态特征将云母片置入95%酒精中浸泡1小时后取出，在酒精灯周围小心烤干。将STBM制剂使用含5%蔗糖的PBS溶液稀释十倍后加入等体积2.5%戊二醛固定2小时后小心吸取1滴到烤干的云母片上，自然风干后镀金，上机观察。 5.动物模型的建立将小鼠STBM制剂用PBS缓冲液（5%蔗糖）稀释至蛋白浓度为0.14mg/ml，PS组于妊娠第10日起每日上午08:00经尾静脉注射稀释后的小鼠STBM制剂，NS组对应于相同时间进行相同处理；PP组于妊娠第10日起每日上午08:00经尾静脉注射PBS溶液（5%蔗糖），NP组对应于相同时间进行相同处理。 6.尿液标本的采集及尿蛋白的测定 PS组及PP组分别于孕10天、孕18天使用小鼠代谢笼采集尿液。采集尿液前禁食12小时，采集尿液时禁食不禁水，容器中加入1ul二甲苯用于防腐，采集12小时尿液，滤纸过滤后使用Improved-lowry蛋白定量试剂盒测定尿蛋白浓度。NS组及NP组对应于相同时间进行相同处理。 7.小鼠尾动脉血压的测定 PS组及PP组分别于孕10天、孕14天、孕18天使用小鼠无创血压仪测定尾动脉血压，测定之前先将小鼠全身（包括尾部）加热，其目的是使尾动脉扩张，待小鼠安静下来后进行测定，重复测定三次取平均值。NS组及NP组对应于相同时间进行相同处理。 8.血浆及脏器标本的采集 PS组及PP组小鼠于孕18天腹腔注射戊巴比妥钠溶液麻醉，待小鼠麻醉后用眼科镊轻轻摘除小鼠眼球，用预先加入枸橼酸钠抗凝剂的EP管接取血液，边接边轻轻摇晃混匀。立即将全血置于冷冻离心机中1000r/min离心10分钟，小心吸取上层血浆，将血浆上机测定活化部分凝血酶时间（activeated partial thromboplastin time，APTT）、血浆凝血酶原时间（Prothrombin Time,PT）、D-二聚体（D-Dimer,D-D）。随后用颈椎脱臼法处死小鼠，立即将小鼠解剖，获取肾脏、心脏，放至4%多聚甲醛溶液中固定，将胎盘及胎鼠迅速使用冰冷生理盐水洗净表面血迹，放至清洁纱布吸干水分后，在电子天平上称重，随后立即将胎盘放入4%多聚甲醛中固定。除胎盘与胎鼠的处理外，NS组及NP组余处理均与PS组及PP组对应于相同时间进行相同处理。 9.HE染色观察小鼠胎盘、肾脏、心脏的病理变化将标本放入4%多聚甲醛溶液固定48小时后，将标本脱水、透明，浸蜡包埋，用石蜡切片机切成厚度为6um的薄片，将切片脱蜡与水化后染色，封片后观察。结果： 1.STBM制剂蛋白含量及TPA含量测得STBM制剂总蛋白含量为0.46mg/ml-0.91mg/ml，平均值为（0.69±0.12）mg/ml，TPA浓度为45.33ng/ml-77.53ng/ml，平均值（61.49±9.78）ng/ml。 2.在扫描电子显微镜下可见STBM为囊泡状结构，有聚集成团的趋势，Image-ProPlus6.0软件测得STBM囊泡的直径为104.47nm-472.71nm，平均值为（228.52±90.06）nm。 3.孕10天时PS组与PP组，NS组与NP组12小时尿蛋白量无显著性差异。孕18天时PS组尿蛋白量较PP组明显增多（P＜0.05），在经过STBM处理后NS组的尿蛋白量较NP组显著增多（P＜0.05） 4.孕10天时PS组与PP组，NS组与NP组血压之间无明显差异。孕14天时及18天时PS组与NS组血压较PP组与NP组显著升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001），PS组及NS组在整个孕期血压呈持续上升趋势，分别与PP组及NP组比较有显著性差异。PP组、NP组血压无明显变化。 5.PS、PP、NS、NP四组之间APTT及D-二聚体差异无显著性，PS组与PP组，NS组与NP组比较PT有显著差异，经过STBM处理后的PS组及NS组的PT时间均较对照组缩短（P＜0.05，，P＜0.05）。 6. PS组发现6例胚胎停育，胎死宫内，其中2例只见胎盘附着于子宫壁，未见胎鼠，将此2例胎鼠体重计为0g，PP组未见死胎、胚胎发育异常等，两组比较有显著差异（P＜0.05）。两组胚胎数量无明显差异，PS组胎盘重量及胎鼠重量均小于PP组（P＜0.001，P＜0.001）。 7.在光镜下观察，各组小鼠心脏未见明显心肌纤维肥大、点状出血或坏死、间质水肿等。PS组及NS组肾小球系膜细胞增生明显，基底膜可见增厚，肾小管上皮广泛水肿，PS组及NS组肾小球内红细胞量明显较PP组及NP组减少。四组肾脏相比较，PS组与NS组较PP组与NP组病变明显。镜下可见胎盘蜕膜带细胞水肿明显，有炎性细胞浸润，基带和迷路带可见滋养叶巨细胞大量增生，聚集成团，部分滋养叶巨细胞可见脂肪样变，迷路带血供减少，部分可见纤维蛋白沉积，血间膜变薄，部分滋养细胞坏死。结论： 1.本研究制备的小鼠STBM制剂在蛋白标志及形态学上均与人类来源的STBM具有高度的相似性； 2.通过STBM回输同种C57小鼠制备的子痫前期动物模型已初步建立，该模型血压、尿蛋白、凝血指标、胚胎发育、肾脏及胎盘的病理表现均与人类PE疾病的临床表现及病理表现相似。 3.这一动物模型是从PE发病的终末阶段来模拟PE的发病，对以STBM为治疗靶点的研究提供了条件，为PE致病环节的研究提供新线索，为PE的临床治疗研究提供了新的方向。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R714.245;R-332

【参考文献】