miRNA对乙型肝炎病毒复制的影响及其机制研究

发布时间：2018-02-12 01:53

  本文关键词： 微小RNA 乙型肝炎病毒 肝细胞癌 乙肝病毒表面抗原 HepG22.2.15细胞 靶基因　出处：《天津医科大学》2008年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的： 在我国乙型肝炎病毒(HBV)相关性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)发病率、死亡率均排名于疾病谱前列,严重危害人民健康,目前尚无满意的治疗方法。为此寻找新的抗HBV治疗方法成为当前急需解决的重要问题。近年发现的microRNA (miRNA),是一种广泛存在于真核生物中、大小约18-25个核苷酸(nt)的内源性单链小分子RNA,参与发育、增殖、分化、凋亡等多种生物学过程。越来越多的研究表明,miRNA也能够调控RNA和DNA病毒的复制。那么,miRNA是否也参与了HBV的复制呢?为此,我们首次研究了靶定于HBV基因组和宿主细胞基因组的人类的miRNA,为研究HBV和miRNA之间的相互作用及其机制奠定初步的实验依据,为今后抗HBV增殖药物的开发提供新的手段和分子基础。 方法： 1.分别用328种miRNA的反义链转染HepG22.2.15细胞,72小时收获上清,MTS检测细胞的增殖活性,ELISA检测表面抗原和e抗原的表达水平 2.将筛选到的对表面抗原产生有抑制作用和促进作用的miRNA的反义链梯度转染HepG22.2.15细胞,72小时收获上清,实时定量PCR检测其中HBV的拷贝数,ELISA检测表面抗原和e抗原的表达水平。 3.用miRanda, TargetScan, PicTar, miRDB和ViTa五个网站预测筛选miRNA在HBV基因组上的靶基因,对于在HBV基因组上没有靶位点的miRNA,网站预测的结果联合mRNA表达谱芯片和RT-PCR技术,对其靶基因做进一步预测。 4.分别构建筛选到的miRNA的过表达载体,包含靶位点的EGFP报告载体和靶位点突变的EGFP报告载体。并且分别在HEK293和HepG22.2.15细胞中进行荧光报告载体实验验证候选的靶基因。 结果： 1.MTS和ELISA的结果显示,在没有对细胞的增殖活性产生影响的情况下,miR-199a-3p, miR-210和miR-185抑制了HBV表面抗原的表达,而miR-370促进了病毒表面抗原的表达。 2.实时定量PCR的结果显示,miR-199a-3p, miR-210和miR-185抑制了HBV的复制,这种抑制作用具有剂量依赖性。 3.网站预测了miR-199a-3p, miR-210, miR-185和miR-370的靶基因,miR-199a-3p, miR-210分别靶定于HBV的表面抗原和表面抗原的启动子2。而在HBV上没有发现miR-185和miR-370的靶位点,通过mRNA表达谱芯片结合生物信息学的方法,我们筛选到miR-185可能的靶基因有PRKCH,ATP5B和NR1D1, miR-370可能的靶基因有FUS和TPM4。并且通过RT-PCR和芯片验证,PRKCH, ATP5B的RT-PCR结果和芯片结果相符。 4.在HEK293和HepG22.2.15两种细胞中,利用荧光报告载体实验验证了miR-199a-3p, miR-210和miR-185与候选基因的直接作用关系,结果显示,miR-199a-3p, miR-210, miR-185分别通过靶定HBsAg, HBSP2和PRKCH,从而抑制了HBV表面抗原的产生以及HBV的复制。 结论： 本研究首次发现了通过直接靶定HBV基因组或者宿主细胞基因,从而抑制病毒表面抗原产生和病毒复制的hsa-miRNA。miRNA作为病毒与宿主细胞相互作用中的调节因子(激活因子或抑制因子),在HBV的生命活动周期中具有重要作用。该研究对于阐明细胞miRNA和HBV之间错综复杂的相互作用提供了依据,对于我们理解宿主和病原体之间内在的相互调控提供很大的帮助,可能为解释病毒的组织嗜性,潜伏感染,和癌原性提供新的理论依据,而且,病毒感染相关miRNA的研究有望成为抗病毒治疗新的重要靶点。
[Abstract]:Objective:
In China, hepatitis B virus (HBV) related hepatocellular carcinoma (hepatocellular carcinoma, HCC) incidence rate, mortality rate ranks in the forefront of the spectrum of disease, serious harm to people's health, there is no satisfactory treatment. Looking for new anti HBV treatment method has become an important problem to solve. In recent years microRNA (miRNA), is a widely exist in eukaryotes, the size of about 18-25 nucleotides (NT) single stranded endogenous small molecule RNA, involved in the development, proliferation, differentiation, apoptosis and other biological processes. More and more studies show that miRNA can regulate RNA and DNA replication. So, miRNA is involved in the replication of HBV? For this, we first studied the target HBV genome and the genome of the host cell of human miRNA, provide a preliminary experimental basis for research between HBV and miRNA and its interaction mechanism, It provides a new means and a molecular basis for the development of anti HBV proliferative drugs in the future.
Method锛，

本文编号：1504514