凋亡细胞体内回输诱导胰岛细胞移植耐受的免疫学机制初步研究

发布时间：2018-02-13 08:00

本文关键词： 调节性T细胞致耐受性树突状细胞胰岛移植免疫耐受　出处：《第二军医大学》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 免疫耐受的维持需要多种机制的共同参与,除了中枢耐受机制外,机体对抗原的克隆忽略以及抗原特异性T、B细胞的克隆失能和克隆清除均参与其中,另外,CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞(T regulatory cell ,Treg)作为一群有抑制功能的T细胞亚群,其在维持机体稳态中的作用也已经得到充分的证实。在移植免疫的研究中,如何诱导供者特异性免疫耐受而不影响到机体对其它抗原的免疫应答,是器官移植研究领域的一个热门研究课题。凋亡作为体内的一种正常的生理过程,不会引起机体强烈的免疫反应。可能有如下机制参与其中,首先,吞噬细胞可以迅速的吞噬凋亡小体防止其中炎性介质的释放,其次,凋亡细胞可以释放一些抗炎因子如IL-10、转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)等调节机体的免疫反应。因此,凋亡细胞具有负相免疫调控功能,应用凋亡细胞预注射诱导移植耐受是近年来防止移植排斥一个重要策略。根据调节性T细胞的来源、产生和发挥作用的机制可以将其分为两大类:胸腺来源的Foxp3+调节性T细胞和可诱导的调节性T细胞。可诱导的调节性T细胞又可以分为产生IL-10的调节性T细胞(Tr1)、产生TGF-β的辅助性T细胞(Th3)和可诱导的Foxp3+调节性T细胞。Treg主要通过以下方式诱导维持免疫耐受:(1)在抗原刺激后,抗原特异性Treg可以通过趋化因子迅速的集中在抗原递呈细胞的周围,从而竞争性抑制抗原反应性T细胞被抗原递呈细胞的激活。(2)与抗原特异性Treg接触的抗原递呈细胞功能下调,妨碍了反应性T细胞的激活。(3)Treg可以分泌颗粒酶、穿孔素、IL-10等抑制性细胞因子。(4)Treg可以通过与反应性T细胞竞争IL-2诱导其凋亡。鉴于调节性T细胞的抗原特异性抑制功能,我们不难联想到它们是否在凋亡细胞诱导的移植免疫耐受中发挥作用,如果Treg在以上过程中起作用,那这部分Treg又是如何产生、如何发挥作用的呢。为了回答上述问题,我们对凋亡细胞诱导特异性免疫耐受的机制进行了进一步的探讨。第一部分凋亡细胞诱导的小鼠胰岛移植免疫耐受的实验观察腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin,STZ)200mg/kg建立小鼠糖尿病模型,三天后即可出现明显的空腹血糖升高,血糖大于18mmol/L者可作为胰岛移植的受体。用无菌Ⅴ型胶原酶(0.5mg/mL)逆行灌注胰腺,将充盈的胰腺取下38℃消化20min,用20%胎牛血清中和胶原酶后RPMI-1640洗两遍。胰岛细胞悬液与OptiPrep? 2:1混合,密度梯度离心20min后,取两层界面之间的细胞,此为较纯的胰岛。镜下观察胰岛呈圆形或卵圆形,有折光性的胞膜,大小不一。双硫腙(DTZ)染色后呈红色。每只小鼠可得胰岛150个左右。无菌取小鼠脾脏,研磨后40μm cell strainer过滤,低渗液Tris-NH4Cl溶解红细胞,低速离心后沉淀重悬后即为小鼠脾细胞悬液。将分离得到的淋巴细胞调整细胞浓度至106 /ml,六孔板中每孔加入1ml淋巴细胞悬液,30w UVB紫外灯距离40cm照射10min,后将照射后的细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640中培养6h,流式细胞仪检测凋亡细胞比例为50-80%。将血糖符合要求的小鼠随机分组,设凋亡细胞注射后移植组,单纯移植组,仅注射凋亡细胞组和无任何处理组。凋亡细胞预注射后移植组尾静脉注射供体小鼠来源的凋亡细胞107 /只,一周后行胰岛移植。将新鲜分离纯化后的胰岛200/只埋植于受体小鼠右肾包膜下。观察各组移植后小鼠血糖及生存期的变化。结果表明,凋亡细胞预注射组小鼠的存活期(106±6天)较之对照组(13±4天)显著延长。耐受鼠血糖由移植前的25.77±3.73mmol/L降低为12.23±4.50mmol/L。而单纯注射凋亡细胞组与未行任何处理组小鼠血糖及生存期几无差别,生存期分别为60±7天和61±9天,少于耐受组。以上结果表明,供者来源的凋亡淋巴细胞预注射可显著提高移植受者的生存期,减轻受体鼠的糖尿病症状。第二部分凋亡细胞诱导的小鼠胰岛移植免疫耐受的机制研究为了研究凋亡细胞引起的供者特异性的免疫耐受,我们选取了存活期大于60天的耐受小鼠作为研究对象。首先采用FACS检测分析了耐受鼠脾脏淋巴细胞CD4~+CD25~+调节性T细胞的数量。检测结果表明,脾脏中CD4CD25双阳性的细胞在耐受小鼠中的比例为7.5±0.6%,明显高于正常未作移植的小鼠(3.3±0.4%)。CD4+Foxp3+调节性T的比例为(6.2±0.8%),也显著高于对照小鼠(3.1±0.4%)。以上结果表明,凋亡诱导的耐受小鼠体内确实有Treg细胞的扩增,提示Treg在诱导维持耐受的过程中发挥了重要作用。将耐受小鼠体内的CD4CD25双阳性的细胞用免疫磁珠分选出来后,加入供者成熟骨髓来源的树突状细胞(BMDC)作为刺激细胞,受体CD4~+CD25~-T细胞作为反应细胞的混合淋巴细胞反应体系,与野生型同品系来源的CD4CD25双阳性细胞相比,受体来源的CD4CD25双阳性细胞可明显抑制T淋巴细胞的体外增殖反应,采用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记反应T细胞,显示耐受鼠的CD4CD25双阳性细胞可明显减少反应T细胞的分裂峰。而对于非供体来源的刺激细胞,耐受鼠Treg细胞对MLR反应的影响与对照组相比无明显差异。这就提示凋亡诱导的Treg具有更强的且是抗原特异性的抑制功能。既然凋亡细胞诱导了特异性的Treg细胞的增殖,那这群Treg到底是如何产生的呢。调节性T细胞的抑制功能的机理有很多种解释,但其来源仍没有确切的答案。新生胸腺切除的小鼠几乎无Treg细胞的产生,提示胸腺是Treg产生的重要场所;Foxp3报告基因小鼠也证实了Treg细胞在胸腺中的发育成熟。但是还有很多实验表明Treg细胞可在某些条件下在胸腺外产生,像初始T细胞在TGF-β存在的情况下被激活的话,细胞内就会有Foxp3的表达。树突状细胞(DC)一直以来被看作免疫调控的中心环节,近年来的实验研究证实DC在Treg的诱生过程中同样发挥着十分重要的作用。为了进一步观察耐受小鼠DC与Treg相互作用在诱导移植物耐受过程中的免疫学机理。我们采用免疫磁珠法分选出耐受鼠脾脏中CD11c阳性的细胞树突状细胞,通过FACS检测其表型。我们发现与野生型小鼠的CD11c+ DC相比,耐受鼠中的DC表面MHCⅡ类分子、CD80、CD86和CD40等共刺激分子明显低表达而抑制性分子程序性死亡配体-1(programmed death 1 ligand , PD-L1 )高表达。这说明耐受小鼠脾脏中的DC呈现一种相对低的成熟状态,表现出致耐受性树突状细胞的表型特点。鉴于以上结果,我们推测该亚群致耐受性树突状细胞在Treg的分化发育中起了作用。将免疫磁珠法分选得到的耐受小鼠脾脏中CD11c阳性的细胞与同系小鼠CD4+ CD25- T细胞1:1共孵育三天后,流式检测T细胞的表型变化。结果发现与耐受鼠脾脏DC共孵育的CD4~+CD25~-T细胞明显上调了Foxp3表达的细胞数(15.76±1.97%),而与野生型小鼠共孵育的T细胞表型则无明显变化(0.15%)。在共培养体系中加入抗PD-L1抗体阻断PD-L1的作用后,致耐受性树突状细胞的这种能力被显著抑制,而阻断与PD-L1共受体的分子PD-L2后转化能力不受影响。提示PD-1/PD-L1共刺激通路参与了耐受性DC与Treg相互作用。进一步的研究表明,耐受小鼠体内的CD4~+CD25~+调节性T细胞在体外共培养体系中可以诱导耐受性DC的产生。我们将耐受小鼠中分选得到的CD4~+CD25~+调节性T细胞与BMDC1:1比例共孵育,三天后检测DC表型的变化,发现与耐受鼠体内调节性T细胞共孵育的DC表面CD40、CD80/CD86等共刺激分子表达明显下调。综上所述,凋亡细胞可以上调移植受体鼠体内调节性T细胞与耐受性树突状细胞的数量,同时通过调节性T细胞与耐受性树突状细胞相互诱生的反馈环路,促进供者特异性移植免疫耐受的发生。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

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