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ZNF580在S1P诱导的内皮细胞迁移和增殖中的作用

发布时间:2018-02-14 01:03

  本文关键词: ZNF580 迁移 增殖 S1P MAPK 内皮细胞 出处:《天津医科大学》2010年硕士论文 论文类型:学位论文


【摘要】:目的:研究人C2H2型锌指蛋白新基因ZNF580在1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phosphate, S1P)诱导的内皮细胞迁移和增殖中的作用,为阐明ZNF580基因的功能提供新的实验依据,为肿瘤血管发生的治疗提供新的可能靶点。 方法:①RT-PCR技术检测S1P受体和ZNF580在EA.hy926内皮细胞的表达情况。②以不同浓度(0-10μM)SIP刺激EA.hy926内皮细胞不同时间(0-12h)后,利用半定量RT-PCR、Western blot方法检测S1P对ZNF580表达的影响。③应用p38mitogen-activated protein kinase(p38MAPK)信号通路特异性抑制剂SB203580预处理EA.hy926内皮细胞1h后,半定量RT-PCR和Western blot方法研究S1P是否通过此信号通路影响ZNF580的表达。④利用pEGFP-ZNF580转染EA.hy926内皮细胞,获得瞬时过表达ZNF580的EA.hy926内皮细胞,即EA.hy926pEGFP-ZNF580;利用化学合成siRNA-ZNF580转染EA.hy926内皮细胞,获得瞬时低表达ZNF580的EA.hy926内皮细胞,即EA.hy926siRNA-ZNF580⑤细胞迁移实验分析ZNF580对内皮细胞迁移特性的影响。⑥MTT比色法分析ZNF580对内皮细胞增殖活性的影响。⑦利用半定量RT-PCR、明胶酶谱方法检测EA.hy926、EA.hy926pEGFP-ZNF580和EA.hy926siRNA-ZNF580三种细胞基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)表达情况。⑧利用半定量RT-PCR、ELISA方法检测EA.hy926、EA.hy926pEGFP-ZNF580和EA.hy926siRNA-ZNF580三种细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达情况。 结果:EA.hy926内皮细胞表达ZNF580,同时表达S1P1(edg1)、S1P3(edg3)、 S1P5(edg8)三种EDG受体,上述基因的PCR特异性扩增产物分别为352bp、701bp、236bp,与预期结果一致;S1P刺激EA.hy926内皮细胞后,ZNF580mRNA和蛋白水平的表达均上调,且有剂量和时间效应。在剂量效应中,S1P浓度为0.1μM时, ZNF580表达开始增加,当S1P浓度为0.5μM, ZNF580的表达水平达到峰值。在时间效应中,当刺激时间为1h时,ZNF580表达开始增加,当刺激时间为4h时,ZNF580的表达水平达到峰值。与正常组比较结果均有统计学意义(P0.05); p38MAPK特异性信号通路抑制剂SB203580能够抑制S1P诱导的ZNF580的上调作用;ZNF580基因过表达(低表达)在促进(抑制)MMP-2和VEGF的表达的同时,内皮细胞迁移和增殖活性明显增强(减弱)。 结论:本实验首次确定了人脐静脉内皮EA.hy926细胞表达ZNF580,并初步阐明了S1P-ZNF580信号在内皮细胞迁移和增殖过程中的作用,为深入研究人C2H2型锌指蛋白新基因ZNF580的功能及其相关信号转导通路提供了实验基础和技术平台,为肿瘤血管发生的治疗提供了新的可能靶点。
[Abstract]:Aim: to study the role of human C2H2 zinc finger protein gene ZNF580 in the migration and proliferation of endothelial cells induced by sphingosine 1-phosphate (S1P), and to provide a new experimental basis for elucidating the function of ZNF580 gene. To provide new possible targets for the treatment of tumor angiogenesis. Methods the expression of S1P receptor and ZNF580 in EA.hy926 endothelial cells was detected by 1: 1 RT-PCR. The effect of S1P on the expression of ZNF580 was detected by semi-quantitative RT-PCR- Western blot. 3. EA.hy926 endothelial cells were pretreated with p38mitogen-activated protein kinasep38 MAPK (p38mitogen-activated protein kinasep38 MAPK) signal pathway inhibitor SB203580 for 1 h. Semi-quantitative RT-PCR and Western blot methods to investigate whether S1P affects the expression of ZNF580 through this signaling pathway, pEGFP-ZNF580 was used to transfect EA.hy926 endothelial cells to obtain transient ZNF580 overexpression EA.hy926 endothelial cells, i.e., EA.hy926pEGFP-ZNF580. EA.hy926 endothelial cells were transfected with chemically synthesized siRNA-ZNF580. EA.hy926 endothelial cells with transient low expression of ZNF580 were obtained. Analysis of the effect of ZNF580 on the Proliferation of Endothelial cells by EA.hy926siRNA-ZNF5805 Cell Migration Assay ..7 the effect of ZNF580 on the Proliferation of Endothelial cells using Semi-quantitative RT-PCR, Gelatin Enzymatic Spectroscopy to detect three kinds of Cell Matrix Metalloproteins, EA.hy926pEGFP-ZNF580 and EA.hy926siRNA-ZNF580. The expression of metalloproteinase-2 (MMP-2) in EA.hy926pEGFP-ZNF580 and EA.hy926siRNA-ZNF580 cells were detected by semi-quantitative RT-PCR- Elisa method. The expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in EA.hy926pEGFP-ZNF580 and EA.hy926siRNA-ZNF580 was detected by RT-PCR. Results the expression of ZNF580 and S1P1P3edg3, S1P5edg8) receptors were expressed in the endothelial cells of 1: EA.hy926, respectively. The PCR specific amplification products of the above genes were 352bpti701bp2bp236bp. the expression of ZNF580 mRNA and protein were up-regulated after stimulated by S1P in EA.hy926 endothelial cells, and the expression of ZNF580mRNA and protein were up-regulated after stimulated by S1P1P, and the expression of ZNF580mRNA and protein were up-regulated by S1P1P. When the concentration of S1P was 0.1 渭 M, the expression of ZNF580 began to increase, and the expression level of ZNF580 reached its peak when the concentration of S1P was 0.5 渭 M. in the time effect, the expression of ZNF580 began to increase when the stimulation time was 1h. When the stimulation time was 4 h, the expression level of ZNF580 reached its peak. Compared with the normal group, the expression level of ZNF580 was significantly higher than that of the normal group, and the p38 MAPK specific signal pathway inhibitor SB203580 could inhibit the up-regulation of ZNF580 induced by S1P and the overexpression of ZNF580 gene (low table). In addition to inhibiting the expression of MMP-2 and VEGF, The migration and proliferation activity of endothelial cells were significantly increased (decreased). Conclusion: the expression of ZNF580 in human umbilical vein endothelial EA.hy926 cells was determined for the first time, and the role of S1P-ZNF580 signal in the process of endothelial cell migration and proliferation was preliminarily elucidated. It provides the experimental basis and technical platform for the further study of the function of human C2H2 zinc finger protein gene ZNF580 and its related signal transduction pathway, and provides a new possible target for the treatment of tumor angiogenesis.
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R322

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本文编号:1509517

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