北京地区人偏肺病毒全基因组序列、血清流行率分析及B细胞表位研究

发布时间：2018-02-15 21:16

本文关键词： 人偏肺病毒全基因组序列核衣壳蛋白融合蛋白血清学调查肽扫描分析 B细胞表位　出处：《北京协和医学院》2009年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：急性呼吸道感染是导致人类,特别是儿童致病和死亡的重要病因。病毒在呼吸道感染中扮演重要角色,近年来随着分子生物学技术的发展,不断有新的病毒发现,尤其是SARS和甲型H1N1流感病毒的出现,进一步提示加强新发病毒性传染病研究的重要性。人偏肺病毒(HMPV)是2001年从下呼吸道感染儿童的呼吸道样本中分离出来的种新的病毒。目前,将HMPV归为副粘病毒科,肺病毒亚科偏肺病毒属。HMPV可感染各年龄人群,症状重者多发于婴幼儿,老年人,免疫抑制人群,可导致上呼吸道和下呼吸道疾病。HMPV的感染存在地区和时间差异。目前,HMPV在我国的流行率尚不清楚,尤其是基于全基因组测序的分子特征研究尚少。此外,缺乏快速有效的诊断HMPV感染的技术。为此,本研究对北京地区HMPV毒株的基因特征和及近年全人群中的血清流行率进行了研究,并首次对HMPV F蛋白的线性表位进行了筛选,为阐明我国HMPV的流行特征和开发特异性免疫诊断技术提供基础。一、北京地区HMPV全基因组序列测定与分析利用RT-PCR方法,对2007年3月-2009年4月期间收集的1542份儿童咽拭子标本进行了检测,HMPV检出率为2.8%。随机选取4份HMPV阳性样本,采用随机PCR方法扩增后,对其进行了鸟枪法测序,获得了全基因组序列。序列分析和进化树分析结果显示,四株均属于A2基因型,与国外代表株属于不同进化分支。4株HMPV F序列与A型(A1/A2亚型)HMPV F序列同源性较高,核苷酸序列同源性分别为97.3-99.8和92.1-93%,而氨基酸序列同源性分别为95.2-100%和94.4-98.5%；与B型(B1/B2)HMPV F蛋白序列同源性较低；4株HMPV实验株G蛋白高变区编码核苷酸序列与DQ843659的相应区域有相对较高保守性,而与其他3株亚型代表株相比,序列保守性较差。二、北京地区正常人群HMPV感染血清流行率研究利用大肠杆菌系统,对HMPV N蛋白进行了表达,经过金属螯合层析纯化,其纯度达到90%以上。利用该抗原建立了ELISA方法,对不同年龄组人群血清中的抗HMPVIgG抗体流行率进行了研究。对1157份正常人群血清的筛查表明,HMPV在人群中感染普遍,≤6个月人群中抗体阳性率为66.67%以上,6月-1岁年龄组略有降低(58.6%),1-2岁为73.47%,随着年龄的增长,抗体阳性率逐渐升高,至20岁之后抗体阳性率达到了100%。相比而言,人呼吸道合胞病毒(RSV)血清抗体IgG抗体水平在≤6月时抗体阳性率为71.40%,6个月-1岁抗体阳性率为84.48%,1-2岁为85.8%,抗体水平随着年龄增高。到20岁以后,抗体水平达到100%。这些数据提示,HMPV在新生儿和婴儿期的感染率可能低于RSV。三、HMPV F蛋白B细胞表位分析将HMPV和RSV的F、N蛋白基因分别插入重组腺病毒载体,获得了表达两种蛋白的4种重组腺病毒。分别将4种腺病毒以滴鼻形式免疫小鼠,制备抗HMPV和f1 RSV的人偏肺病毒和人呼吸道合胞病毒的N蛋白以及F蛋白的抗血清。利用获得的小鼠血清分别与HMPV和RSV的F和N蛋白反应,可见HMPV和RSV之间存在交叉免疫反应。利用获得的小鼠血清和HMPV IgG阳性人血清,利用55条合成肽,通过Pepscan分析技术,对HMPV F蛋白的B细胞表位进行了初步筛选。结果显示,33条多肽可与人血清反应,其中12条多肽可与小鼠抗RSV F蛋白血清反应,其中10条与人血清筛选结果重叠。说明二者存在交叉性表位。综上所述,本研究通过了解人偏肺病毒北京株的基因组特征和北京地区正常人群中感染情况以及B细胞表位的初步筛选,为评估HMPV疾病负担和其变异趋势,提出防控策略以及建立特异性免疫诊断技术和血清流行病学研究方法提供了必要的理论依据。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R373

【参考文献】