不同接种密度培养胎鼠脊髓神经前体细胞的实验研究

发布时间：2018-02-21 18:14

本文关键词： 神经前体细胞贴壁培养接种密度诱导分化　出处：《大连医科大学》2008年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 背景:脊髓损伤(SCI)是骨科的多发病之一,后果严重,预后差,如何有效治疗一直是临床上的难题。随着神经细胞体外培养的成功,外源性神经细胞移植治疗SCI成为了研究的热点。供体细胞的选择是移植的第一步。近年来,随着对谱系限制性神经前体细胞进一步的研究,使其成为了供体细胞的良好选择。然而,目前对于谱系限制性神经前体细胞的贴壁培养技术仍无系统研究。本实验研究的谱系限制性神经前体细胞来源于胎鼠脊髓神经前体细胞(NPC),通过比较NPC在不同接种密度下的生物学特性,旨在为NPC贴壁培养技术的建立提供参考。神经前体细胞包括神经干细胞和谱系限制性神经前体细胞,这些细胞均具有分化成熟的能力。神经干细胞是神经系统中最原始的细胞,具有高度分化潜能,一直是细胞移植研究领域的热点。Cao.Q.L等研究表明,将神经干细胞移植入成鼠的损伤脊髓后,移植的细胞只能分化成星型胶质细胞,这是因为损伤后的脊髓微环境不支持神经干细胞向神经元方向分化。近年来,Han S.S.等研究发现这种微环境却允许神经元限制性前体细胞(NRP)和胶质限制性前体细胞(GRP)的存活及分化,因此谱系限制性的神经前体细胞(NRP/GRP)作为细胞移植供体成为了新的研究热点。神经前体细胞的培养方法有很多种,目前应用最多的是悬浮培养法以及贴壁培养法。在悬浮培养方式下,细胞聚集成为神经球,增殖旺盛,培养的细胞逐渐纯化为以神经干细胞为主;在贴壁培养方式下,使NPC黏附于经过特殊处理的培养瓶或培养板上生长,其增殖能力相对较弱,但贴壁培养的细胞经过逐渐纯化后以NRP/GRP为主。所以NPC的贴壁培养近年来受到了越来越多的重视,但不同学者贴壁培养NPC的密度不尽相同。因此,如何改善NPC的培养方法,使其具有最佳的生物学活性,需要我们进一步的研究。目的: 1.探讨不同密度接种胎鼠脊髓神经前体细胞的存活率,贴壁率,增殖率,以及移植前神经干细胞、神经元限制性前体细胞、胶质限制性前体细胞的比例。 2.观察贴壁培养的神经前体细胞经诱导后能否分化为成熟的神经细胞。材料和方法:取孕13.5天的SD大鼠胚胎脊髓组织,按1.25×104/cm2、2.5×104/cm2、5×104/cm2、10×104/cm2,四个不同密度接种于层粘连蛋白(20μg/ml)和多聚赖氨酸(13.3μg/ml)包被的培养瓶及培养板中,培养三天后: 1.分别用MTT法计算细胞存活率;用高倍镜下计数计算贴壁率;用流式细胞仪行Brdu增殖率、Nestin、PSA-NCAM、A2B5抗体检测。 2.培养3天后更换培养液为分化培养基继续培养,每3天换液1次,培养一周。结果: 1.四个细胞密度组由低到高:MTT均值分别为0.2597、0.14535、0.076925、0.0474625;贴壁率均值分别为96.673%、95.40%、94.173%、87.708%;流式细胞仪检测下Brdu标记阳性细胞百分率分别为58.00%、37.45%、52.80%、41.62%;Nestin阳性细胞百分率分别为4.13%、1.04%、1.97%、2.27%;PSA-NCAM抗体阳性细胞百分率分别为24.65%、40.75%、10.50%、8.65%;A2B5抗体阳性细胞百分率分别为41.55%、39.52%、6.61%、12.88%。 2.以2.5×104/cm2接种细胞后,经胎牛血清诱导后可分化成熟,其NF-200,GFAP,Gal-C抗体阳性。结论:细胞存活率随接种密度的增高而降低;细胞贴壁率随接种密度的增高而降低;细胞经体外培养,其增殖率与接种密度无明显相关性;神经干细胞所占的比例无明显差异,谱系限制性神经前体细胞(PSA-NCAM阳性细胞+A2B5阳性细胞)的比例以第二组为最高,达到了80%以上,并与其他组有显著差异(p0.01)。本实验显示NPC适宜的种植密度为2.5×104/cm2。该组细胞经诱导分化后可以分化成为神经元,星形胶质细胞及少突胶质细胞。
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【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R329

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