ABO血型抗体对K562细胞红系定向分化抑制作用的研究

发布时间：2018-03-02 07:03

本文关键词： 纯红细胞再生障碍性贫血 K562细胞诱导定向分化血型抗体血型基因荧光定量PCR 凋亡机制　出处：《广州中医药大学》2010年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 背景 ABO血型系统位于第九染色体上(9q34.1-9q34.2), ABO血型抗原有三种类型,分别是水溶性糖蛋白、醇溶性糖蛋白和膜糖蛋白。ABO血型抗原均以H物质作为基础物质,H物质由19号染色体上的FUT基因座编码的α2-L-岩藻糖转移酶(α2-L-fucosyltransferase,α2-FUT)作用于血型前体物质而产生。ABO血型抗体分为天然抗体和免疫性抗体,天然抗体属于IgM性质的抗体,免疫性抗体属于IgG性质的抗体。ABO血型抗原不依赖HLA基因复合物遗传,在HLA相合异基因造血干细胞移植中供受者主要ABO不合者约占11.7%-28%。纯红细胞再生障碍性贫血(pure red cell aplasia, PRCA)是主要ABO血型不合异基因造血干细胞移植的主要并发症之一,异基因造血干细胞移植后PRCA的发生机制还未完全明了,但它可能与受者凝集素(抗体)与供者红细胞的ABO抗原不匹配有关。有报道A型和B型抗原表达于红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E),红细胞系集落形成单位(CFU-E)和部分不断分化的抗原阳性细胞上,ABO血型不合异基因造血干细胞移植后发生纯红再障原因可能与受者体内残余的B淋巴细胞或浆细胞等抗体分泌细胞有关,这些细胞可以继续生成同种不匹配的凝集素(抗体)而与供者红细胞ABO抗原发生作用。目前的研究表明移植后PRCA的总发生率为8%,且这种并发症主要发生在主侧而不是双侧ABO血型不合的造血干细胞移植(hemopoietic stem cell transplantation, HSCT)患者。现已确认的PRCA两个主要危险性因素是移植前未降低同种凝集素(抗体)的效价和A或AB型供者干细胞移植给0型受者。含抗A凝集素(抗体)的受者合并高发生率的PRCA原因可用抗A抗体比抗B抗体的浓度高且持续时间久来解释。抗供者同种凝集素(抗体)效价在PRCA中的作用已在文献中多次报道,IgM中位滴度是1：128(1：2-1：4096)，IgG是1：512(1：2-1：16000),这些效价是使用各种不同的技术评定的。大部分作者提出移植前高效价的同种凝集素(抗体)是所观察到的PRCA的一个主要影响因素,但还没有病例能清晰地将PRCA的发生率和高效价之间的相关性进行深入的研究 A和B抗原是由A、B基因座位上的等位基因分别编码的寡糖基转移酶作用于H抗原而形成的。红细胞等组织细胞膜上的脂溶性H抗原与体液、分泌液中的水溶性H抗原的产生,分别受控于由H(FUT1)和Se(FUT2)位点的等位基因编码的两种特异性不同的α2-岩藻糖基转移酶(α2-FUT)作用。 H抗原是在α1,2岩藻糖基转移酶的催化下,将GDP-L-fucose上的岩藻糖基转移到前体糖链上而形成的。α1,2岩藻糖基转移酶的受控基因有2个(FUTl和FUT2),其中FUT1基因控制H抗原在红系组织表达,而FUT2基因(或Se基因)控制H抗原在分泌液中的表达。FUT1基因定位于19号染色体,有4个外显子,而蛋白质编码序列位于第4外显子,糖基转移酶分子由365个氨基酸组成。人体内存在与FUT1高度同源的FUT2基因,FUTl和FUT2基因的产物均为岩藻糖基转移酶,该酶将岩藻糖连接到糖链前身物质而形成H抗原。FUTl基因控制红细胞膜上H抗原的表达,而FUT2基因控制分泌液中岩藻糖基转移酶的活性。H血型抗原唯一依赖的是FUTl基因的产物FUT1酶的作用,无活性的FUT1等位基因在纯合子状态不能表达H抗原,无活性的FUT2基因不会影响红细胞表面H抗原的表达,只会影响体液中H抗原的表达。 H抗原与ABO血型关系密切,是A和B抗原的前身物,ABO基因位于染色体9q34上而决定H抗原表达的FUTl和FUT2基因位于染色体19q13.3, FUT1和FUT2基因间隔不到100kb,二者70%的核苷酸序列相同。前者编码365个氨基酸构成a(1，2)-岩藻糖基转移酶,后者编码332个氨基酸构成a(1，，2)-岩藻糖基转移酶,因各自作用的底物不同,最终使得FUT1基因决定H抗原在红细胞上的表达,FUT2基因决定H抗原在分泌腺和消化液中的表达岩藻糖转移酶是调节碳水化合物合成的关键酶,基于它们的受体特异性和他们的主要氨基酸序列,它们被分为两大家族：a(1，2)岩藻糖转移酶(FUT1和FUT2)和a(1,3)岩藻糖转移酶(FUT3, FUT4, FUT5, FUT6和UT7),它们分别参与H物质和Lewis相关抗原的合成。目前,7种岩藻糖转移酶已被各自定位和复制,FUT1是把岩藻糖从GDP岩藻糖转移到Ⅱ型双糖末端半乳糖的H基因编码的a(1,2)岩藻糖转移酶,这种酶对Ⅰ型双糖活性很低。另一个a(1，2)岩藻糖转移酶FUT2是由分泌基因(Se)编码,从GDP岩藻糖转移到Ⅰ型双糖末端半乳糖。FUT3是一个a(1,3/1,4)岩藻糖转移酶,相当于Lewis型岩藻糖转移酶,它可以将更多的转移残余岩藻糖到Ⅰ型双糖N-乙酰氨基葡萄糖,用于Lewis x, Lewis y, Lewis a, Lewis b, sialyl-Lewis x和sialyl-Lewis a抗原的合成。FUT4是a(1,3)岩藻糖转移酶,作用于Lewi s x和Lewis y的合成。FUT5和FUT6是另外两个a(1,3)岩藻糖转移酶,可以合成Lewis x和sialyl-Lewis x,而FUT7仅能合成sialyl-Lewis x。主要ABO血型不合异基因造血干细胞移植后患者发生纯红细胞再生障碍性贫血发病机不明,推测与体液免疫机制介导的红系前体细胞破坏和抑制有关,PRCA患者自身ABO血型抗体抑制了供者型红细胞在体内的生成和血型的转换,但缺乏实验室证据。K562细胞株是一种人红白血病细胞系,基本处于多能髓样祖细胞阶段而停止继续分化,然而一些极性化合物如氯化高铁血红素(Hemin)可以诱导其向红系分化。在诱导剂作用下,K562细胞向红系分化成熟的不同阶段,其基因表达谱会发生不同的变化。本研究拟用氯化高铁血红素诱导K562细胞向红系定向分化,观察ABO血型抗体对K562细胞红系定向分化的干预作用,研究血型抗体对红系分化成熟和对血型基因表达的影响,本研究有助于揭示ABO血型不合移植后PRCA的发生机制。目的研究ABO血型抗体对K562细胞红系定向分化的干预作用机制,探讨不匹配的ABO血型抗体对红系分化成熟过程的干预作用机制和对血型抗原表达的影响,从细胞实验入手探讨PRCA的体液免疫作用机制。方法 1.含10%胎牛血清的RPMI-1640培养K562细胞株。 2.使用不同浓度的Hemin诱导K562细胞向红系定向分化,通过联苯胺染色法测定细胞内血红蛋白的含量来检测K562细胞红系定向分化的成熟度。 3.血型抗原检测法：使用吸收放散实验、微量淋巴细胞毒实验检测诱导后K562细胞表面ABO血型抗原。 4.使用测序的方法检测K562细胞株的ABO血型。 5.采用常规MTT法测定K562细胞在不同浓度抗H作用下的细胞增殖抑制率。 6.用Trizol法提取不同浓度抗H作用于诱导后K562细胞的总RNA。 7.使用SYBR GREEN荧光定量PCR法检测不同浓度抗H作用于诱导后K562细胞FUTl基因的相对表达量。 8.使用Annexin V/PI法检测不同浓度抗H作用于诱导后K562细胞的凋亡结果 1.不同浓度hemin诱导不同天数的K562细胞后K562细胞内的血红蛋白合成量不同,以50uM/L诱导K562细胞4d后细胞内血红蛋白合成量最高。 2.诱导后K562细胞表面血型抗原表达过弱,其ABO血型抗原用吸收放散试验,微量淋巴细胞毒试验等常规方法无法检测到。采用基因测序方法确认K562细胞株ABO血型为0型。 3.MTT检测K562细胞经hemin诱导及不同浓度的抗H试剂作用后,1：8与1：16稀释组组间差异有统计学意义。当抗H稀释度≤1：8时对细胞增殖有明显的抑制作用。 4.荧光定量PCR检测结果显示不同稀释度抗H作用于诱导不同天数后的K562细胞,FUT1基因的表达量有明显的变化,当抗H稀释度≤1：16时,对细胞FUT1基因的表达有明显的抑制作用。 5.细胞凋亡检测显示,抗-H抗体可促使红系定向分化后的K562细胞凋亡,随加入的抗-H试剂稀释度的增高,细胞凋亡率明显降低,当抗-H抗体1：16倍稀释以上时,细胞凋亡率无明显差异。结论 1.不同浓度的Hemin诱导K562细胞向红系定向分化的效果不同。 2.ABO血型抗体对经诱导后向红系定向分化的K562细胞的增殖有抑制作用。K562细胞在向红系定向分化过程中代表红细胞特异性的细胞内血红蛋白的合成量有明显提高,但其细胞表面血型抗原的表达却很弱。 3. K562细胞在向红系定向分化过程中,表达H抗原的FUT1基因表达量有所增加,但一定浓度的抗H抗体可以抑制FUT1基因的表达。 4.在一定浓度范围内,ABO血型抗体可通过细胞凋亡途径抑制K562细胞向红系定向分化成熟。细胞试验证明ABO血型抗体可抑制干细胞红系定向分化成熟,ABO血型抗体可能在PRCA的发生中起重要作用。 5.本研究建立的FUT1基因荧光定量检测方法可检测出基因表达量的变化,为研究红细胞表面ABO血型基因表达建立了新方法。 6.本研究为临床ABO血型不合异基因造血干细胞移植后PRCA发生机制提供了新思路。
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【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

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