二甲氧基硫代磷酸酯类农药单克隆抗体研制及单链抗体三维结构模拟

发布时间：2018-03-02 13:18

  本文选题：有机磷农药　切入点：单克隆抗体　出处：《南京农业大学》2009年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：依据二甲氧基硫代磷酸酯类有机磷农药的共有结构,设计了含有二甲氧基硫代磷酸酯结构和苯环结构的通用半抗原,即3-[4-(O,O-二甲基硫代磷酰氧基)苯基]-1-丙酸(Hapten1, H1)。采用活泼酯法分别将H1与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶联合成免疫原和包被原。将制备好的免疫原H1-BSA,免疫6-8周龄雌性BALB/c鼠,每次每只小鼠的免疫原用量100μg。以HI-OVA作为包被原,用非竞争间接酶联免疫分析法(ELISA)检测多次免疫后的小鼠血清效价并选择效价较高的小鼠用于细胞融合。采用PEG介导的细胞融合技术将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,建立可稳定分泌抗二甲氧基硫代磷酸酯类有机磷农药抗体的杂交瘤细胞株。经ELISA法筛选及有限稀释法亚克隆,成功建立了两株对甲基对硫磷、甲基毒死蜱、倍硫磷、甲基立枯磷、杀螟硫磷和马拉硫磷六种二甲氧基硫代磷酸酯类有机磷农药具有明显的识别作用的杂交瘤细胞株(D12-B5、E5-H2)。通过体内与体外培养大量制备单克隆抗体,并经盐析、蛋白亲和层析获得纯度较高的抗体。用非竞争间接ELISA法检测效价,非竞争酶免疫实验测定亲和力,竞争间接ELISA法测定抗体的特异性。选效价较高的杂交瘤细胞株D12-B5为研究对象,用小鼠亚型分析试剂盒测定出所分泌的抗体为IgG1、κ型,亲和常数达1.709×109L/mol。以H1-OVA作为包被原,采用竞争间接ELISA法测定出抗体对甲基对硫磷、甲基毒死蜱、倍硫磷、甲基立枯磷、杀螟硫磷和马拉硫磷六种农药的150分别为42.1μg/mL、60.2μg/mL、75μg/mL、13.58μg/mL、117μg/mL和172.9μg/mL。 为了分析不同结构的异源包被原对抗体检测灵敏度的影响,将与甲基对硫磷、甲基毒死蜱、倍硫磷和杀螟硫磷结构相似的半抗原用活泼酯法与OVA偶联形成不同化学结构的异源包被原。实验结果表明与分析物(农药)的结构相似的异源半抗原并不能提高单克隆抗体对该农药的检测灵敏度,但宽谱性抗体与H7-OVA的组合可使甲基对硫磷和甲基毒死蜱竞争间接ELISA的150值分别可达到0.58μg/mL、0.81μg/mL。 根据以上异源包被原的分析结果选择H7-OVA作为包被原,采用矩阵滴定法确定抗原抗体的最佳组合,通过对离子强度、pH值等影响因子的研究,确定ELISA的最佳工作参数,建立定量测定的间接竞争ELISA方法。通过ELISA条件优化,确定了甲基对硫磷和甲基立枯磷的ELISA的最佳工作条件,建立了定量测定甲基对硫磷和甲基立枯磷的间接竞争ELISA方法,甲基对硫磷的150和检测限(120)分别为0.165μg/mL、0.0144μg/mL,甲基立枯磷的150和检测限(120)分别为0.95μg/mL、0.033μg/mL。 在此基础上,选择效价较高的小鼠脾细胞和较高亲和力的杂交瘤细胞株,提取总RNA,用鼠类重链、轻链可变区通用引物,通过反转录PCR,扩增两种细胞可变区基因。通过重叠延伸PCR (SOE-PCR)将可变区基因通过连接肽基因连接起来,构建单链抗体基因,克隆到T载体中,通过PCR和测序进行鉴定。其结果显示从小鼠脾细胞和杂交瘤细胞中成功地扩增到了重链和轻链可变区基因,大小在300 bp左右；采用SOE-PCR获得约750 bp大小的单链抗体基因,并克隆到T载体。经测序证实,轻重链可变区基因均符合小鼠可变区基因的特征,轻重链之间是由45 bp连接肽基因连接。 在Discovery Studio软件服务器上,利用同源蛋白结构预测的方法模建单链抗体三维结构模型,并验证了三维结构的合理性。从构建的单链抗体(ScFv)三维结构模型中看出,单链抗体的轻、重链的超可变区(CDR)均暴露在抗体结构的表面,并形成桶状结构,这种结构非常有利于抗体与抗原的结合。单链抗体三维模型的模建为进一步分析轻、重链在抗体功能中的作用,为改造抗体、提高抗体活性等方面奠定了基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【参考文献】

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本文编号：1556689