幽门螺杆菌临床分离株HsP60分子特征及其对IL-8诱生作用的研究

发布时间：2018-03-05 16:13

  本文选题：幽门螺杆菌　切入点：热休克蛋白60　出处：《滨州医学院》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：分析幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)临床分离株热休克蛋白60 (heat shock protein 60, Hsp60)基因编码区序列特征,并通过定点突变及构建原核表达系统制备野生型与突变型Hsp60重组蛋白,研究两种重组蛋白对胃上皮细胞IL-8诱生作用的差异。方法：1.将不同疾病来源的胃黏膜标本研磨后,均匀涂布于Hp选择培养基上,37℃微需氧条件下培养3天,培养物经菌落特征、革兰染色、快速尿素酶试验和氧化酶试验鉴定；2.提取所有分离到的Hp的基因组DNA,根据GeneBank中已公布的HpATCC26695菌株Hsp60基因的全长序列,采用Primer Premier50软件设计一对引物,PCR扩增Hsp60基因,切胶纯化后进行序列测定,采用DNAstar 5.0软件中的MegAlign程序进行比对分析；3.采用Primer Premier5.0软件设计Hsp60基因的两对引物,引入突变位点,以Hp ATCC26695基因组DNA为模板,通过重叠延伸PCR法进行3次PCR扩增,获得突变型Hsp60基因；另利用上下游引物,PCR扩增野生型的Hsp60基因；4.将野生型与突变型的Hsp60基因克隆至pEASY-E1载体,构建原核表达系统,进行重组蛋白的诱导表达；利用脱盐柱及内毒素去除柱对重组蛋白进行纯化；并进行蛋白浓度及内毒素含量的测定；5.将纯化的野生型及突变型Hsp60蛋白与胃上皮细胞GES-1共培养,收集上清液,ELISA检测IL-8的表达水平。结果：1.将标本接种于Hp选择培养基置微需氧环境中37℃培养3天后,培养基上出现针尖大小的透明菌落。革兰氏染色后油镜下可见弧形、海鸥状以及S形的革兰阴性菌,且尿素酶、氧化酶试验均为阳性,为Hp临床分离株。2.非胃癌来源与胃癌来源Hp的Hsp60基因的编码区序列在877、1 399以及1579位点处存在差异：在877位点处发生了G→A的碱基置换,上述两种来源菌株数分别为8株(8/45,17.78%)和3株(3/18,16.67%)；在1399位点处发生了C→G的碱基置换,菌株数分别为9株(9/45,20.00%)和1株(1/18,5.55%)；在1 579位点处发生了A→G的碱基置换,菌株数分别为7株(7/45,15.56%)和2株(2/18,11.11%)；以上三位点所对应的氨基酸序列,即293、467以及527位点处,分别发生了由缬氨酸(V)到异亮氨基酸(I)、谷氨酰胺(Q)到谷氨酸(E)以及苏氨酸(T)到丙氨酸(A)的改变。3.定点突变后,经测序比对分析,Hp ATCC26695 Hsp60基因的编码区序列1398、1399位点由原来的AG突变为GC。4.构建pEASY-El-Hsp60原核表达载体,SDS-PAGE检测,在相对分子质量55-72 kDa处有一明显条带,与预期的6His-Hsp60融合蛋白大小一致。当菌液OD600为0.4,IPTG终浓度为1.0 mM,诱导时间4 h时,目的重组蛋白表达量相对较高。5.将重组蛋白与细胞共培养后,蛋白组比PBS对照组的IL-8浓度高,且加入内毒素抑制剂PMB后IL-8浓度的降低没有统计学意义(P0.05)；在蛋白浓度为50μg/ml时,突变型Hsp60组和野生型Hsp60组IL-8的表达差异具有统计学意义(P0.05)。结论：1.成功分离到63株不同疾病来源的临床Hp菌株,为后续研究Hp致病性差异建立了菌株资源基础。2.非胃癌来源与胃癌来源Hp的Hsp60基因的编码区序列在877、1 399以及1579位点处存在单核苷酸多态性。3.本研究制备的HpHsp60重组蛋白可以诱导GES-1细胞产生炎症细胞因子IL-8,且与内毒素污染无关；野生型与突变型Hsp60对胃上皮细胞的炎症诱生作用存在差异,且突变型强于野生型。
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【学位授予单位】：滨州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378
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本文编号：1570967