Ⅰ.eIF2B结构功能研究及其与VWM的关系 Ⅱ.rRNA加工受mTOR的调控及对S6K1的调节

发布时间：2018-03-06 06:00

本文选题：白质消失病　切入点：真核细胞翻译起始因子2B　出处：《复旦大学》2010年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：elF2B(eukaryotic initiation factor 2B中文名：真核细胞翻译起始因子2B)在mRNA的翻译和调控中发挥了关键的作用。eIF2B由5个亚基(α-ε)构成,eIF2Bε是五个亚基中最大的一个,它包含了负责催化eIF2 GDP/GTP互换反应的催化结构域。eIF2Bε与eIF2Bγ显示出巨大的序列相似性,二者形成了一个催化亚复合体,这个催化亚复合体与eIF2Bα,β和6亚基形成的调节亚复合体形成全复合体。eIF2B基因突变会导致一种名为VWM(vanishing white matter disease中文名：脑白质消失病)的神经系统病变,这种疾病的临床表型非常多样。为了有助于我们理解VWM的病因,我们研究了eIF2B复合体的整合和VWM突变对eIF2B功能的影响。我们的数据显示,eIF2Bε和eIF2BγN (?)(?)区域特定的保守残基对于这2个亚基之间以及它们与调节亚复合体之间的相互作用是非常重要的。这个区域与核苷酰转移酶蛋白家族显示出同源性,但是在此类蛋白质中的保守氨基酸残基并不是GDP/GTP互换反应所必需的。eIF2Bε和γ中的第二个保守区域同样与亚基间的相互作用相关,这个区域包含一系列重复出现的支链氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸、颉氨酸,eIF2Bε的He 385发挥了重要的作用。我们还研究了elF2Bβγδε内部的一系列VWM突变,这些突变对eIF2B复合体的形成和GEF活性都显示出不同程度的影响,这种多样性可以帮助我们理解VWM临床表型的多样性。具体来说就是：(Ⅰ)一些突变,特别是在催化结构域的突变会导致活性的降低；(Ⅱ)在催化结构域的VWM突变会导致eIF2B无法与其底物结合；(Ⅲ)与之相对的是某些VWM突变如V73G反而显示出增强的活性；(Ⅳ)某些eIF2Bβ,γ或δ的VWM突变对复合体形成和GEF活性只有很小的影响或是没有影响；(Ⅴ)eIF2Bδ突变A391D和R483W都会导致先天性疾病,但是他们对于elF2B复合体的形成及活性却有着完全相反的作用(R483W会严重地影响复合体形成和GEF活性,而A391D对两者都没有影响)。因此,在疾病的严重性和突变导致的eIF2B体外生化性质改变之间没有明显的相关性,某些突变可能会影响eIF2B的其他功能(目前末知)。这些数据扩展了我们对于eIF2B复合体的结构组织的认识,并且有助于我们进一步了解这个关键蛋白因子以及它在VWM中的作用。 mTOR(mammalian target of rapamycin)在细胞内以两种不同的复合体形式存在,即mTORC1和mTORC2。有关mTORC2的功能研究得还不是很充分,已知的包括调控细胞骨架重排,细胞存活等。mTORC1作为细胞内的中枢调节因子参与了多种细胞进程的调控,如蛋白质合成、基因转录、细胞周期进程、自噬、核糖体的生物合成等。核糖体的合成是细胞分裂过程中非常重要的,进化上高度保守的,需要高度协调的复杂进程,对于细胞保持合适的增殖速度和稳定的细胞大小是必须的。核糖体的合成需要三个RNA多聚酶协同作用才能够精密地完成,PolⅠ负责转录核糖体47S pre-rRNA; PolⅡ负责转录核糖体蛋白质的(?)nRNA; PolⅢ负责转录5s rRNA。mTORC1调控核糖体的生物合成已经成为一个不争的事实,对于其调控机制在酵母中研究也取得了令人瞩目的成就。在酵母中的研究显示,TORC1能够在细胞核和细胞质之间穿梭,并且能够直接和PolⅠ启动子结合,磷酸化相关的转录因子,直接激活PolⅠ的转录。类似的,TORC1也能够与TFIIIC结合磷酸化mafl,解除其对PolⅢ的抑制,而酵母的核糖体蛋白质的表达也在转录水平被mTORC1调节。人们试图在哺乳动物细胞中重复类似的研究,已经取得了一些成就,但也发现了一些与酵母中完全不同的调控方式：哺乳动物mTORC1也在核质间穿梭,并且能够直接与TFIIIC结合磷酸化MAF1进而激活polⅢ的转录,mTORC1也能够激活polⅠ的转录,但是至今没有证据显示mTORC1能够直接与polⅠ启动子结合,磷酸化并激活相关的转录因子。而mTORC1对哺乳动物核糖体蛋白质的调控已经被证明是在翻译水平而不是转录水平,而mTORC1对于rRNA加工的调控还不是很清楚。在本研究中,我们发现mTORC1能够直接和rRNA加工过程中的重要蛋白质BOP1在体内和体外直接的相互作用,而缺乏N端264个氨基酸的一个负显性突变虽然在体外可以与mTORC1相互作用,但是在体内却不能,暗示细胞定位对于其相互作用是必须的。此外,我们发现BOP1所在的PeBoW复合体缺陷(siRNA沉默实验和表达负显性突变实验)能够作用于mTORC1信号通路,提高(?)nTORC1下游底物S6K1的磷酸化水平和激酶活性,而不会影响(?)nTORC1另一底物4EBP1的磷酸化水平,这种只针对S6K1的特异性调控与Actinomycin D以及rapamycin的效果类似。这暗示mTORC1对于其下游不同的底物可以以不同的方式进行调控。此外,我们发现BOP1内部有个mTORC1底物特异性基序--TOS基序,突变这个基序会减弱BOP1△的负显性表型(对S6K1的反馈激活,对rRNA加工的阻断和对细胞周期的抑制)。并且我们发现,这种调控不像DNA损伤压力那样是通过激活p38MAPK通路激活mTORC1。我们还发现BOP1是一个磷酸化蛋白质,暗示BOP1在翻译后水平受到某些激酶的调节,以迅速响应细胞内外的信号转导事件。BOP1S126S127是其磷酸化位点之一,PKA和CKII能够在体外磷酸化BOP1。我们的结果显示mTORC1在rRNA的加工过程中发挥了重要的作用,另外PeBoW复合体特异性的rRNA加工阻断会作用于mTORC1并特异性地激活S6K1,对十这种现象的生物学意义还不是很清楚。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R346

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