细胞间接触在诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化中作用的实验研究

发布时间：2018-03-06 12:15

  本文选题：骨髓间充质干细胞　切入点：平滑肌细胞　出处：《第三军医大学》2010年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 尿失禁是女性的常见病,据报道全世界患者有2亿以上,其中又以压力性尿失禁为主,已成为重要的妇女健康问题,影响生活质量。导致SUI的关键机制主要有两种,尿道固有括约肌缺陷(intrinsic sphincter deficiency,ISD)和膀胱颈支撑功能障碍。目前,治疗SUI的方法包括手术治疗和非手术治疗,但这些方法均只能解决膀胱颈支撑功能障碍,不能纠正ISD,因此长期疗效不理想,且并发症多。利用干细胞的再生潜能,修复括约肌缺陷,治疗SUI已经成为目前尿失禁研究的热点。 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)为成体干细胞的一种,是一群来源于中胚层的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞,它们可以在体外经诱导后最终分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、肌管、神经细胞与支持造血干细胞的基质。MSCs具有取材方便、扩增迅速、可自体移植等特点,因此,利用MSCs的多向分化的特性及通过基因修饰能在体外表达多种外源目的基因的特性,将其作为种子细胞用于细胞治疗和基因治疗的研究已成为当前研究的热点。但是目前的研究的中,体外诱导它分化产生的平滑肌细胞在数量和功能上均难以达到改善治疗压力性尿失禁的目的。现阶段的研究已证实移植的MSCs能在组织微环境中分化成与其周围细胞生物学特性相似的细胞,认为干细胞能够对环境中的调节信号做出适应性改变,而其分子机制尚不清楚,因此本研究模仿体内细胞生存的微环境,将其向SMCs诱导,初步探讨细胞间接触在MSCs向SMCs分化中的作用,为MSCs作为种子细胞用于组织工程研究提供理论基础。 本研究以SD大鼠为研究对象,分别利用密度梯度离心法和酶消化法,分离培养了BMSCs和BSMCs;模仿体内细胞生长的微环境,建立大鼠膀胱平滑肌细胞诱导BMSCs向SMCs分化的体外共培养模型,在共培养前后,检测膀胱平滑肌细胞诱导BMSCs的成肌分化标志蛋白表达变化;在共培养的基础上阻断细胞间缝隙连接,检测抑制细胞间连接后对BMSCs向SMCs分化情况的影响。主要实验方法及结果如下: 一、骨髓间充质干细胞和膀胱平滑肌细胞分离培养及鉴定 1.无菌条件下取一月龄雌性SD大鼠双侧股骨,冲出骨髓,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,DMEM-12培养,获得贴壁细胞,监测细胞生长曲线,流式细胞仪检测其免疫表型,采用不同条件培养基诱导细胞向成脂、成骨分化。和生长情况。结果:分离的骨髓单核细胞培养后呈纺锤体样,其分子免疫表型为: CD44、CD90阳性;CD31、CD45阴性。在不同的诱导条件下,BMSCs可形成脂滴、骨结节结构,成功分离并培养了BMSCs。 2.无菌条件下取一月龄雌性SD大鼠膀胱,采用胰酶消化法分离单个核细胞,HG-DMEM培养,获得贴壁细胞,监测细胞生长曲线,免疫荧光法鉴定其标志蛋白的表达。结果:平滑肌特异性的a-SMA, Calponin和SM-MHC表达阳性,证实分离并培养了膀胱平滑肌细胞。 二、BMSCs向SMCs分化的体外共培养模型的建立与鉴定 1.建立大鼠BSMCs诱导BMSCs向SMCs分化的体外共培养模型,在共培养前后,检测BSMCs诱导BMSCs的成肌分化标志蛋白表达变化。以悬挂式细胞培养小室transwell底层的多孔膜(1um)作为BMSCs和BSMCs之间的间隔,细胞分泌的细胞因子,胶原等物质可通过膜上的孔相流通,多孔膜上下两面的细胞可通过膜上的孔进行细胞间接触,但细胞不能通过。将BMSCs和BSMCs分别接种于多孔膜两侧作为接触共培养实验组,将BMSCs接种于多孔膜上,BSMCs接种于六孔板底,使得两种细胞仍处在一个培养环境中,之间距离900μm,两种细胞分泌的细胞因子仍可以通过多孔膜膜孔相互影响,但是不发生接触作为非接触共培养实验组,以单独培养的BMSCs作为对照组,在共培养的第4天和第8天的免疫荧光法和Western blot法检测BMSCs中平滑肌特异性蛋白的表达情况,在共培养1,2,3天检测实验组中BMSCs的平滑肌特异性蛋白基因的表达情况。结果:免疫荧光法、Western blot法和qRT-PCR均显示随共培养时间的延长,接触组的BMSCs中SMC特异的蛋白的表达量增加,而非接触组与共培养前无明显变化,提示细胞间的接触在诱导BMSCs向SMCs分化方面起了重要的作用。 2.正庚醇阻断细胞间缝隙连接对BMSCs向SMCs分化的影响。初步实验证明细胞间接触共培养可以很好的诱导BMSCs向SMCs分化,正庚醇阻断缝隙连接后可以有明显的抑制BMSCs向SMCs分化,进一步证明缝隙连接在在诱导BMSCs向SMCs分化方面起了重要的作用。 结论:本研究通过模拟体内细胞生长分化的微环境环境,建立了大鼠膀胱平滑肌细胞诱导BMSCs向SMCs分化的体外共培养模型,证明了BMSCs与平滑肌细胞间的直接接触是诱导分化的重要因素之一,利用这种方法可进一步深入研究MSCs的分化机制,提高分化效率,为BMSCs移植治疗压力性尿失禁提供理论支持。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【参考文献】

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1 段继宏,杨勇,吴士良,潘柏年,那彦群,薛兆英,郭应禄;北京地区尿失禁发病率调查[J];北京医科大学学报;2000年01期

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本文编号：1574793