RT-PCR检测实验小鼠自然和实验感染鼠诺瓦克病毒及病毒分离

发布时间：2018-03-07 10:03

本文选题：诺瓦克病毒　切入点：鼠诺瓦克病毒　出处：《东华大学》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：诺瓦克病毒(Noroviruses, NVs)又称诺如病毒或小圆结构病毒(Small round structured virus),是1972年在美国首次发现的新生病毒,直到1995年国内才有报道。NVs是一组世界范围内引起的急性无菌性胃肠炎的重要病原,在全球感染人的非细菌性胃肠炎疾病的病例中超过90%是由该病毒引起的。该病毒是严重危害人类健康的重要食源性病毒,可导致不同年龄阶段人群的急性病毒性腹泻。被NVs感染的食品、水源和NVs感染者排泄物引起的粪口传播是造成NVs感染的主要途径,特点是发病率高、致病剂量低和对外界的抵抗力较强。感染的急性胃肠炎临床主要包括：恶心、呕吐、腹泻、腹痛、发热、厌食等。NVs属于嵌杯状病毒科的诺瓦克病毒属,直径约27-35nm,无囊膜,是单股正链RNA病毒的统称。NVs基因全长约7.7kb,包括3个开放阅读框(open reading frames, ORFs),依次是ORF1、ORF2和ORF3。NVs可分为5个基因群(gene group, GG),分别为GGⅠ、GGⅡ、GGⅢ、GGⅣ和GG V。其中NVGGⅠ、NVGGⅡ和NVGGⅣ主要感染人类,NVGGⅢ感染牛,NVGGⅤ则感染鼠类动物。由于NVGGⅤ只在鼠类动物体内发现,因此又被称之为鼠诺瓦克病毒(Murine noroviruses, MNV)。研究表明,MNV在生物学、遗传学、分子学上的特征都与NVs一样；病毒的大小、形状、浮力密度、基因结构也与NVs很相似。NVs在体外不能增值,而MNV却可以在传代细胞小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞上生长并产生细胞病变,因此MNV成为了NVs的替代病毒进行研究,也是唯一的理想研究模型。MNV在实验动物中广泛传播,几乎所有的实验小鼠对此病毒易感。报道称MNV在粪便中能存留较长一段时间。因此,本研究从上海地区的实验小鼠中采集小鼠粪便或者盲肠内容物进行RT-PCR检测,并在RAW264.7细胞上生长分离得到MNV病毒。 1.为了解实验小鼠自然感染MNV的情况,采集送检的80只实验小鼠的粪便样本,应用RT-PCR方法扩增粪便样本的MNV ORF2特异性基因(187bp, MNV nt5473-5659)片段。对PCR检测为阳性的粪便样本经过10倍体积的PBS稀释以后灌胃到4只ICR小鼠体内,一周以后,将3只ICR小鼠与灌胃的小鼠同居饲养,观察小鼠是否出现异常症状,定期采集粪便做RT-PCR检测,研究小鼠实验感染MNV的情况。一个月以后,处死小鼠,采集粪便、盲肠、十二指肠、脾、肝、大脑、肾、肺、心脏、胸腺、子宫、卵巢和唾液腺等器官做RT-PCR检测,研究MNV的主要感染部位。结果表明：自然感染的阳性率为13.75%(11/80)；实验感染的小鼠外表健康、活泼、没有腹泻现象,阳性率为100%；主要的感染部位为小鼠的消化系统。本研究是首次在上海地区实验小鼠粪便中检测到MNV。 2.RAW264.7细胞以5×106细胞/平板的密度培养在60mm的平板上,CO2孵化箱培养24个小时,直到形成80%～90%的单层细胞。将培养液倒掉,500μLPCR阳性结果的粪便悬液接种到RAW264.7单层细胞上。CO2孵化箱培养1个小时后,用无血清的培养基洗脱两次,加10mL含5%的胎牛血清,培养48小时,使用Leica DMI3000显微镜拍照,观察细胞的病变效应。将平板保存在-80℃冻存,24小时后,平板置于室温融解,经过三次冻融以后,3000r/min离心5min,去除细胞碎片,上清液用于提取MNV的RNA,反转录成cDNA,进行PCR。结果表明：目的条带为187bp,与预期的相符。本研究成功的分离培养了MNV病毒。
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【学位授予单位】：东华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373;R3416

【参考文献】