艾滋病毒Vpr蛋白抑制KSHV裂解性周期复制：GSK-3β信号通路的作用

发布时间：2018-03-09 13:22

本文选题：慢病毒　切入点：HIV-1　出处：《南京医科大学》2010年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:研究人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)病毒蛋白R(viral protein R,Vpr)对卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)裂解性周期复制的影响,并对此过程所涉及到的信号通路进行鉴定。方法:1、包装和鉴定含Vpr基因的重组慢病毒,并进行滴度测定。以重组慢病毒Vpr感染原发性渗出性淋巴瘤细胞系【primary effusion lymphoma,PEL,又称体腔淋巴瘤(body cavity-based lymphoma,BCBL)】来源的BCBL-1细胞,反转录RCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和免疫印迹(Western blot)分别检测Vpr基因的mRNA转录和蛋白表达。2、用病毒感染方法将Vpr基因导入PEL细胞系,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time PCR)、RT-PCR和Western blot检测KSHV裂解期基因的mRNA转录和蛋白表达;进一步检测感染后细胞上清中KSHV病毒含量,并以RT-PCR和Western blot检测经上清感染的Vero细胞中KSHV裂解期和潜伏期基因mRNA转录和蛋白表达;将重组慢病毒Vpr感染PEL细胞系,然后转染含KSHV ORF50/ORF73基因启动子的虫荧光素酶(Luciferase)报告质粒,检测Luciferase活性。3、以重组慢病毒Vpr感染BCBL-1细胞,提取细胞总RNA进行人信号通路发现者PCR芯片操作,采用Western blot对基因芯片结果进行验证,加入信号通路上关键蛋白激酶抑制剂、过表达突变质粒后再检测KSHV裂解期蛋白的表达。结果:1、携带Vpr基因的慢病毒获得成功包装,病毒滴度为4×107Tu/ml。重组慢病毒Vpr感染BCBL-1细胞后可检测到Vpr基因的转录和表达。2、Vpr蛋白不但可以显著抑制BCBL-1细胞中KSHV裂解期基因ORF50(编码KSHV“分子开关”蛋白)、ORF26(编码KSHV次要衣壳蛋白)mRNA的转录,而且还能够显著降低KSHV裂解期蛋白病毒白细胞介素6(viral Interleukin-6,vIL-6)和KSHV复制与转录激活子(replication and transcription activator,Rta,即“分子开关”蛋白)的表达。BCBL-1细胞中过表达Vpr蛋白一方面能够显著下调KSHV的病毒拷贝数,同时明显地降低了Vero细胞中KSHV ORF73/LANA【潜伏相关核抗原,(latency-associated nuclear antigen)】、ORF26 mRNA的转录及vIL-6蛋白的表达。Vpr蛋白能够直接抑制ORF50和ORF73基因启动子的活化。3、Vpr蛋白降低了GSK-3β【糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)】信号通路中GSK-3β的磷酸化水平,应用GSK-3β抑制剂LiCl及过表达其突变质粒GSK-3β-S9A后,Vpr蛋白对KSHV vIL-6的抑制作用分别被进一步增强和部分阻断。Vpr蛋白下调了PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)信号通路中PTEN的磷酸化水平,应用其过表达质粒pTEN后,Vpr蛋白对KSHV vIL-6的抑制作用被进一步增强。Vpr蛋白还降低了Ras/c-Raf/MEK/ERK信号通路中c-Raf、MEK1/2及ERK1/2的磷酸化水平。结论:1、含Vpr基因重组慢病毒可以有效地感染BCBL-1细胞,并在其中大量表达目的蛋白。2、Vpr蛋白能够显著抑制KSHV裂解性周期复制及子代病毒颗粒的释放,作用机制可能是通过抑制ORF50和ORF73基因启动子的活化。3、Vpr蛋白通过抑制GSK-3β及PTEN信号通路的活化下调KSHV复制,Ras/c-Raf/MEK/ERK信号通路可能参与调控Vpr蛋白抑制KSHV复制过程。推测在AIDS相关的KS(AIDS-KS)患者体内,Vpr蛋白有可能通过抑制KSHV裂解性周期复制来避免KSHV感染细胞后过早地被免疫清除,从而有利于潜伏感染的形成和肿瘤的发生。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R373

【参考文献】