17β-雌二醇对ox-LDL诱导人外周血内皮祖细胞凋亡的影响

发布时间：2018-03-11 11:49

  本文选题：17β-雌二醇　切入点：内皮祖细胞　出处：《泸州医学院》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 目的:观察17β-雌二醇(17β-estradiol, 17β-E2,以下简称E2)对由氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)凋亡的影响及其影响机制,旨在探讨雌激素抑制动脉粥样硬化和减少女性冠心病的可能机制。过去有关雌激素对EPCs影响的研究多着重于促进EPCs增殖迁移和血管生成方面,而对EPCs凋亡方面则重视不够。本实验使用ox-LDL作为诱导剂来观察E2对内皮细胞的前体EPCs凋亡的影响。由于ox-LDL在动脉粥样硬化(AS)中的重要地位,因此雌激素抑制由ox-LDL诱导的凋亡更能说明其抗AS作用。本研究还就E2对抑制凋亡的机制和途径进行观察,即观察E2是否通过其受体起作用,是否与PI3K/Akt途径有关。方法:(1)外周单个核细胞的分离:肝素抗凝抽取人外周血50ml(肝素1000U)。PBS对倍稀释,按1:1加在人淋巴细胞分离液上,2000R/min离心,吸取中间白膜层单个核细胞,1500R/M离心洗涤三次,取细胞悬液与等体积2g/L台盼蓝混合,进行细胞活力计算(死细胞-蓝色、活细胞不着色),活细胞数占98%以上可进行接种。以上在抽取血样后四小时内完成。(2)诱导分化:纤连蛋白用PBS溶解稀释为1 ng/ml后包被24孔板,每孔中加入100ul ,置于37℃温箱中孵育2h ,临用前吸出多余的液体,用PBS洗涤两次。分用M199培养液调整细胞密度,接种于培养瓶中,成纤维细胞多于24小时内贴壁,因此培养24小时后取未贴壁细胞以4×106/cm2密度接种于包被有纤维连接蛋白(FN)的24孔培养板(每孔M199培养液1 ml),添加10 %胎牛血清、1 %青链霉素(1万单位/ml)、VEGF 50 ng/ml、b-FGF 1 ng/ml,置于5%CO2、饱和湿度、37oC孵育箱中培养四天,用磷酸盐缓冲液洗掉非贴壁细胞,换培养液继续培养至7d ,进一步用PBS洗掉非贴壁细胞,贴壁细胞供实验用。(3)EPCs鉴定:利用免疫组化法检测细胞表抗CD34及VEGFR-2 ;利用免疫荧光法检测细胞表抗CD 133;用EPCs特异性抗体DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1对贴壁细胞进行免疫荧光染色。(4)EPCs调亡的观察:采用异硫氰酸荧光素标记的Annexin-v、碘化丙锭(PI)双染色免疫荧光法检测EPCS的凋亡。贴壁细胞直接用盖玻片来培养7d后,用PBS洗涤两次,在500ul的Binding Buffer中加入2ul异硫氰酸荧光素标记的Annexin-v、5ul PI混匀。将上述溶液加于盖玻片表面,使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖,避光,室温反应10分钟。将盖玻片倒置于载玻片上,于荧光显微镜下双色滤光片观察。(5)E2对EPCs凋亡的观察:用不同浓度E2干预经ox-LDL诱导凋亡的EPCs,观察其剂量依赖性及时间依赖性。(6)机制研究加入雌激素受体阻断剂ICI182,780及PI3K抑制剂LY294002后观察凋亡的影响。结果:1. E2对EPCs的自然凋亡有抑制作用,100 nmol/L浓度E2作用下的凋亡率为(8.23±0.6)%,与空白对照组(12.31±0.34)%的凋亡率相比有明显的统计学意义(P0.01)。2. E2抑制ox-LDL诱导的EPCs凋亡具有剂量依赖性。在E2浓度10nmol/L-100 nmol/L范围内随着其浓度的增加,在干预24h后检测,其抗凋亡的作用逐渐增强。在10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L浓度E2下凋亡率依次为(22.39±0.68)%、(20.42±2.56)%、(13.93±0.3)%,与ox-LDL诱导组(31.43±1.05)%的凋亡率比较,有显著的统计学意义(P0.01)。在干预48h后检测凋亡率依次为(23.28±0.64)%、(19.25±1.16)%、(14.57±0.45)% ,与24h结果的比较无明显统计学意义(P0.05)。3.雌激素受体阻断剂ICI182,780与PI3K抑制剂LY294002能够明显抑制E2的抗凋亡作用,加入雌激素受体阻断剂ICI182,780组的凋亡率上升至(28.6±1)%,加入PI3K抑制剂LY294002组的凋亡率上升至(25.2±1)%,与E2组(13.9±0.3)%的凋亡率相比有明显统计学意义(P0.01)。结论:1.17β-雌二醇具有抑制人外周血内皮祖细胞凋亡的作用。2.ox-LDL具有诱导人外周血内皮祖细胞凋亡的作用,而17β-雌二醇可以呈浓度依赖性的对抗ox-LDL诱导内皮祖细胞凋亡的作用。3.17β-雌二醇抑制ox-LDL诱导人外周血内皮祖细胞凋亡作用的机制与雌激素受体及PI3K通路有关。
[Abstract]:Objective: To observe the effect of 17 beta estradiol (17 P -estradiol, 17 P -E2, hereinafter referred to as E2) by oxidized low density lipoprotein (ox-LDL) induced vascular endothelial progenitor cells (endothelial progenitor cells, EPCs) apoptosis and its influence mechanism, aims to explore the estrogen suppression of atherosclerosis and possible mechanisms for reducing coronary heart disease in women the study of the past. The influence of EPCs on estrogen more focus on promoting the proliferation and migration of vascular EPCs, and apoptosis of EPCs is not enough attention. This experiment using ox-LDL as an inducer to observe precursor EPCs on apoptosis of endothelial cells. Because of the E2 ox-LDL in atherosclerosis (AS) plays an important role in therefore, estrogen inhibits the apoptosis induced by ox-LDL can explain its anti AS effect. This research also studied the mechanism of E2 apoptosis and the way is to observe whether E2 works through its receptor 鐢，

本文编号：1598041