构建重组Galectin-9腺病毒及其对移植小鼠Treg细胞分化和增殖的影响

发布时间：2018-03-11 19:11

本文选题：Galectin-9　切入点：脂多糖　出处：《第二军医大学》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 近几十年来,人们对蛋白和基因的研究有很大的突破,但是对于早期发现的广泛存在于细胞表面且表达各异的糖缀合物却知之不多。Galectin(半乳糖凝集素)是细胞质蛋白,广泛地分布于细胞内外,可以靶向分泌到细胞核内或在胞浆中,与细胞质和细胞核中的蛋白相互作用,传导细胞信号,调节mRNA的剪切、细胞周期、细胞增殖和细胞的凋亡。或者通过非经典途径和内质网高尔基体复合物,释放到细胞外基质中,连接细胞外基质中包含β-半乳糖苷的糖缀合物和细胞表面的黏附因子,调节细胞的黏附和分化。至今已经成功克隆了15个家族成员,Galectin-1及Galectin-3等已研究得较为深入。 Galectin-9是半乳糖结合蛋白家族的成员之一,属于动物凝集素,能够与细胞表面和细胞间质中的半乳糖特异性的结合,发挥细胞之间以及细胞与间质之间的信号传递作用。Galectin-9结构上具有两个羰基结合区域(CRD),分子量为36 kDa,中间由连接肽连接,具有比较明确的激活嗜红细胞,分化单核细胞的作用。人类Galectin-9是在Hodgkin's病人的组织克隆出来的,并广泛分布于人体。其生物活性主要介入细胞黏附,增殖,凋亡,细胞周期。在免疫反应中,可以在T细胞浸润的组织中不同的细胞上如内皮细胞、成纤维细胞、肺上皮细胞和心肌细胞等检测到。提示Galectin-9在调控免疫反应中起重要作用。最新文献提示Galectin-9在数种肿瘤中有抗转移潜力,例如乳癌,鳞状细胞癌。还有报道Galectin-9可诱导树突状细胞成熟。 T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(T cell immunoglobulin mucin 3,TIM3)是分化成熟Th1细胞表达的分子,而不表达在Th2细胞表面,现已证明Galectin-9作为其配体,此途径已明确是Th1细胞免疫作用的重要调节因子,可诱导Th1细胞的凋亡。且以鼠重组Galectin-9结合TIM-3可显著抑制同种异体移植排斥和延长同种异体皮肤移植的生存。免疫抑制是通过免疫抑制剂对T、B淋巴细胞的活化、分化好增殖的抑制以及诱导调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)的负向调节发挥抑制免疫系统的作用。CD4~+CD25~+Tregs亚群具有免疫调节功能,是机体内调节性T细胞的主要类型,于1995年首次由Sakaguchi等提出。CD4~+CD25~+Tregs的免疫学特点是免疫无反应性和免疫抑制性,可以通过下调机体的免疫应答维持对自身和非自身抗原的免疫耐受,CD4~+CD25~+Tregs数量低下和功能紊乱可导致多种自身免疫性疾病,另外,它们在某些严重的炎症性疾病和下调肿瘤免疫应答中也起重要作用。CD4~+CD25~+Tregs以细胞接触依赖性方式抑制CD4~+和CD8 +T细胞。在无抗原呈递细胞出现的情况下仍可发生抑制现象,说明细胞间接触方式是在抑制T细胞与反应T细胞间进行的,CD4~+CD25~+Tregs通过它们的TCR活化成为抑制性效应T细胞,细胞一旦激活,其抑制功能是非特异性的,可抑制CD4和CD8 T细胞的活性。CD4~+CD25~+Tregs还抑制自然杀伤细胞、B细胞以及其他免疫细胞的功能。在人类也发现了Tregs参与免疫耐受的证据,Tregs升高往往与移植器官功能良好、免疫耐受的出现等呈现正相关。转录因子Foxp3基因参与Treg细胞的中枢性和外周性生成过程,并影响Treg细胞免疫调节功能的发挥。 Galectin-9是半乳糖凝集素之一,诱导嗜酸性细胞,肿瘤,及T细胞的凋亡,优先诱导CD4~+T细胞凋亡,我们设想通过分析Galectin-9是否能在体能诱导Treg细胞的分化和增殖,负向调节发挥抑制免疫系统的作用,从而影响受体对移植物的免疫耐受的形成。因此本实验首先构建小鼠重组腺病毒载体pAdeasyTM- Galectin-9,经PCR、酶切、测序鉴定及Westernblot检测,结果显示,携带小鼠Galectin-9基因的腺病毒载体构建成功。经过病毒的扩增及滴度检测,我们构建的小鼠pAdeasyTM- Galectin-9腺病毒获得了较高的滴度。通过将外源性重组Galectin-9输入小鼠心脏移植模型体内观察对移植物生存的影响,并且观察Treg细胞的分化,增殖,探讨Galectin-9可能诱导免疫耐受的作用提供新的思路。第一部分Galectin-9腺病毒载体的构建腺病毒载体因其具有基因组结构简单、宿主细胞范围广、滴度高、感染效率高、无插入突变危险等优势,因此我们选择了AdEasy? Adenoviral Vector System体系构建Galectin-9载体。首先取经过LPS刺激4小时后的小鼠脾脏,抽提其mRNA,然后根据报道及Genebank发布的基因和蛋白序列,设计带酶切位点的特异性引物,RNA逆转录PCR(RT-PCR)扩增获得小鼠Galectin-9全长基因序列,双酶切后连接到AdEasy? Adenoviral Vector System体系中的pShuttle-CMV中,然后与pAdeasy-1同源重组,在293A细胞中包装出带有Galectin-9目的基因的腺病毒pAdeasy- Galectin-9。通过PCR、酶切、测序鉴定及Westernblot检测,结果显示,携带小鼠Galectin-9基因的腺病毒载体可高表达Galectin-9蛋白,说明带有目的基因Galectin-9的腺病毒构建成功。经过病毒的扩增及滴度检测,我们构建的小鼠pAdeasy- Galectin-9腺病毒获得了较高的滴度。第二部分重组Galectin-9腺病毒对小鼠心脏移植模型调节性T细胞增殖的影响的实验研究目的:通过观察重组Galectin-9腺病毒、空病毒及对照组生理盐水对小鼠异位心脏移植术后移植心脏生存时间、脾脏CD4~+CD25~+Treg细胞增殖情况和Foxp3的表达的影响,探讨Galectin-9诱导免疫耐受的可能性及其机制。方法:应用Cuff法建立雄性BALB/C→C57BL/10小鼠颈部异位心脏移植模型,根据术后用药情况,受体分为3组(n=10);对照组(术后用生理盐水)、空病毒组、重组Galectin-9腺病毒治疗组。记录移植心脏生存时间,于移植心停搏或术后14d取脾,分离单个核细胞,上流式细胞仪检测CD4~+CD25~+Treg细胞。半定量RT-PCR检测Foxp3mRNA表达水平。结果:与对照组比较,重组Galectin-9腺病毒组明显提高移植心脏的生存时间(p0.01),空病毒组在延长生存时间方面与对照组比较无明显差异(p0.05);与对照组比较,重组Galectin-9腺病毒组CD4~+CD25~+Treg细胞占CD4~+ T细胞比例明显升高(12.20% vs 7.35%,p0.01),空病毒组CD4~+CD25~+Treg细胞占CD4~+ T细胞比例无明显差异(6.90% vs 7.35%, p0.05);重组Galectin-9腺病毒组T细胞Foxp3 mRNA表达明显高于对照组(P0.01);空病毒组T细胞Foxp3 mRNA表达与对照组比较无明显差异(p0.05)。结论:小鼠心脏移植后使用重组腺病毒Galectin-9明显提高了移植心脏的生存期,小鼠心脏移植后使用空病毒与对照组生理盐水比较对提高移植心脏的生存期无明显影响,重组腺病毒Galectin-9体内促进CD4~+CD25~+Treg细胞的增殖与生长;而空病毒在体内对CD4~+CD25~+Treg细胞的增殖与生长无明显影响;体内实验Foxp3与CD4~+CD25~+Treg细胞呈正相关。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【共引文献】