源自经培养间充质干细胞的转化细胞群的研究

发布时间：2018-03-13 22:26

本文选题：间充质干细胞　切入点：转化　出处：《暨南大学》2010年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：实施成体干细胞治疗的关键之一是获得足够数量的细胞数,及有效向功能细胞终末分化的诱导。最近研究发现：骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增时可能出现不正常的转化细胞群,因此,通过体外培养对成体干细胞进行扩增,从而获得足够用于干细胞治疗细胞数这一常规策略的安全性愈来愈被人们所关注。前期研究中,我们发现：对大鼠源性的骨髓间充质干细胞进行体外培养及传代扩增时,会产生呈圆形、克隆样生长且可形成类胚体样结构的转化细胞群,应用贴壁分离法、分步胰蛋白酶消化法和有限稀释法组合方法,我们已经将该转化细胞群分离。对该转化细胞群研究发现：该细胞群具有高增殖能力(可稳定传代至220代)且体外经5-氮胞苷(5-Aza,一种DNA转甲基酶抑制剂)处理后具有心肌分化潜能。该细胞群不表达间充质干细胞表面标志物：CD90；不表达造血干细胞表面标志物：CD34和CD45；内皮祖细胞标志物：CD31, flk-1及T细胞标志物：CD4。经长期传代处理后该细胞群的表型、倍增时间、细胞周期分布及心肌分化潜能都未有显著变化,复制性衰老不明显。在本博士学位论文中,在上述基础上对该经分离的转化细胞群的如下问题进行研究：(1)形成情况的统计分析；(2)超微结构；(3)特异性标志物；(4)生长特性；(5)time-lapse研究;(6)核转染及标记示踪；(7)基因表达谱研究；(8)Oct4(干细胞多能性转录因子之一)基因沉默对其增殖的影响；(9)端粒酶活性检测；(10)核型分析；(11)体内成瘤性分析。本博士学位论文对上述问题进行研究并发现：使用DMEM培养基对小鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养时未见该转化细胞群,使用IMDM培养基分别对10只成年SD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养时发现有6只出现了该转化细胞群,其中2只原代培养时出现、1只第3代时出现、1只第4代时出现、2只第5代时出现。使用IMDM培养基分别对4只老年SD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养时发现有3只出现了该转化细胞群,其中2只原代培养时出现、1只第4代时出现。应用扫描电镜及透射电镜对经分离的代表性细胞群(E1单细胞克隆)超微结构进行分析,发现该转化细胞群直径为6-9μm,具有较高的核质比且富含线粒体,细胞质中含少量颗粒。应用基因表达芯片结合实时定量PCR技术对该细胞群的表面标志物进行进一步鉴别,发现该转化细胞群间充质干细胞代表性表面标志物CD73呈阳性而CD105呈阴性；B细胞标志物CD19呈阴性,同时还表达一些自身特有的标志物：CD9、CD24、CD63、CD68、CD81、CD276和CD302均呈阳性。体外培养发现该细胞群接触抑制不明显,既可贴壁生长,当长满后,细胞可立体向上突起立体生长,悬浮的该细胞再培养也可再贴壁生长。应用活细胞time-lapse技术对该细胞群进行观察也证明上述生长特性,同时也发现该细胞群大约需要6-7小时分裂一次。经Fast-Dil标记该转化细胞群E1单细胞克隆细胞与经培养2天新生大鼠心肌细胞共培养3天后,呈红色荧光的该转化细胞群可表达心肌特异性标志物心肌肌钙蛋白Ⅰ；同时,对该细胞群体内研究发现：往行冠状动脉前降支结扎模型大鼠的尾静脉注射经Fast-Dil标记该细胞群,7天后在缺血心肌中发现呈红色荧光的经注射细胞团,并表达心肌特异性标志物心肌型肌钙蛋白Ⅰ,提示：该细胞群具有体内心肌靶向潜能,并有向心肌分化的潜能。使用基因芯片对该细胞群(E1单细胞克隆)经5-Aza处理前后差异基因分析结果发现：在26,419个检测基因中,663个基因显著受5-Aza调控(倍变2),其中118个基因上调2倍,545个基因下调2倍。GO分析工具MAS2.0按分子功能和生物学过程将差异基因分类。基于MAS2.0的分析结果,5-Aza处理后下调大于2倍基因若按Molecular Function分类,主要富集在rRNA binding、RNA binding、mRNA binding(前3个且p0.05)；若按Biological Process分类,主要富集在complement activation, classical pathway、negative regulation of RNA splicing、hydrogen peroxide biosynthesis(前3个且p0.05)；上调大于2倍基因若按Molecular Function分类,主要富集在calcium ion binding、L-lysine transporter actiy、dimethyladenosine transferase activity (前3个且p0.05)；若按Biological Process分类,主要富集在cell adhesion、smoothened signaling pathway involved in spinal cord motor neuron cell fate specification lysine transport(前3个且p0.05)。应用KEGG数据库分析受5-Aza调控通路,发现上调基因参与通路有(前3个且p0.05)：ECM-receptor interaction通路、Glycosphingolipid biosynthesis-ganglioseries通路和Chondroitin sulfate biosynthesis通路,下调基因参与的通路有(前3个且p0.05)：Complement and coagulation cascades通路、Oxidative phosphorylation通路和Alzheimer's disease通路。应用TRAP-银染法对该细胞群端粒酶活性进行检测发现第70代及第212代具有端粒酶活性,且第212代较第70代的活性水平高。应用核转染技术对该细胞群进行GFP(绿色荧光蛋白)基因转染标记并进行体内示踪研究,发现经转染细胞能保持其细胞形态、增殖及分化潜能,转染效率受代数影响不明显,经心肌内注射经标记细胞在体内可维持表达GFP约1周。免疫荧光检测发现：不同代数该细胞群稳定表达Oct4,随后应用RNAi技术对该细胞群中Oct4基因进行沉默,48小时后发现该细胞形态从小圆形变为大扁平样,生长变得极为缓慢。应用染色体G显带技术对该细胞群经有限稀释筛选后的四个不同单细胞克隆D6、E1、G11和H7进行染色体核型分析,发现该细胞群染色体数日异常,D6单细胞克隆59.3%为39条染色体、E1单细胞克隆70.5%为39条染色体、G11单细胞克隆60.7%为39条染色体,H7单细胞克隆68.0%为39条染色体,其中以缺失第19、20号染色体为主(D6单细胞克隆24.6%缺失19号,37.7%缺失20号；E1单细胞克隆30.5%缺失19号,38.9%缺失20号；G11单细胞克隆23.7%缺失19号,40.6%缺失20号；H7单细胞克隆28.8%缺失19号,32.2%缺失20号)。将该细胞群(E1单细胞克隆)通过皮下注射及尾静脉注射移植至裸鼠体内60天进行成瘤性实验,未发现形成肿瘤。本学位论文研究提示常规的体外扩增大鼠间充质干细胞可引起永生化及不致瘤性的自发转化,该细胞群既具有类干细胞特性,具有高增殖能力、可形成类胚体且具有体内外向心肌分化潜能,也具有类肿瘤细胞特性,接触抑制不明显、可立体生长及染色体异常。该细胞群可能是一种介于间充质干细胞和肿瘤细胞之间的过度状态的细胞群,可作为新的细胞类型进行深入研究,深入对该类细胞的特性研究,可能有助于对成体干细胞及肿瘤干细胞的认识,同时也十分有助于研发安全可靠的成体干细胞疗法,本研究也提示：使用体外培养扩增成体干细胞去实施干细胞治疗时,应在确保细胞的正常性的前提下,才能进入临床研究。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R329

【引证文献】