氧化应激对乳鼠心肌细胞Sonic hedgehog表达的影响以及小鼠急性心肌梗塞模型的制备

发布时间：2018-03-14 21:39

  本文选题：音猬因子　切入点：心肌细胞　出处：《广州医学院》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 第一部分氧化应激对乳鼠心肌细胞Sonic hedgehog(Shh)表达的影响 目的: Hedgehog家族是一类分泌信号蛋白,主要调节胚胎中多种器官和组织的形成。近年发现其与成年组织干细胞增殖、多种癌症的形成有关。在小鼠中一共有三种hedgehog基因,分别是Sonic hedgehog (Shh),Indian hedgehog (Ihh)和Desert hedgehog (Dhh),由这三种基因编码而成的信号都激动同样一条信号级联放大通路。Hh信号传递受靶细胞膜上两种受体Patched (Ptc)和Smoothened (Smo)的控制。受体Ptc由肿瘤抑制基因Patched编码,是由12个跨膜区的单一肽链构成,能与配体直接结合,对Hh信号起负调控作用。受体Smo由原癌基因Smoothened编码,与G蛋白偶联受体同源,由7个跨膜区的单一肽链构成,N端位于细胞外,C端位于细胞内,Smo是Hh信号传递所必须的受体。当Ptc和Hh结合以后,解除对Smo的抑制作用,促使Gli蛋白与Costal2,Fused和Fused的抑制因子作用后与微管形成大分子复合物,使得全长Gli蛋白进入核内激活下游靶基因转录。已有研究表明Shh与许多血管生成因子有关,能促进VEGF的表达,参与血管的生长,对急、慢性心肌缺血模型以及缺血再灌注损伤模型有显著治疗作用;又有研究表明HH在动物糖尿病模型中阴茎海绵体、神经、血管等组织中表达下降,并参与糖尿病模型神经及其滋养血管的修复和皮肤伤口的愈合。我们之前的研究已经证实了糖尿病小鼠心肌组织中Shh表达下降,但其下降的原因还未可知,由于糖尿病病程中氧化应激发挥作用已经成为了一个不争的事实,所以本课题主要探讨氧化应激是否能导致心肌细胞中Shh信号蛋白表达的降低。 方法: 选用原代培养的新生SD大鼠心肌细胞。用RT-PCR方法检测心肌细胞内Shh mRNA表达的变化;Western blot法检测心肌细胞内Shh蛋白表达的变化。 结果: 1.使用黄嘌呤氧化酶/黄嘌呤(xo/x)浓度分别为xo (0.5u/L)/x(0.5mM)和xo(1u/L)/x(0.5mM)作用于心肌细胞24小时后,提取心肌细胞总RNA,检测细胞内Shh mRNA表达的变化。以管家基因GAPDH为内参,与正常对照组相比,不同浓度的xo/x分别使心肌细胞内Shh mRNA表达降低40.1%和59.2% (P0.05)。另外在氧化应激的基础上(xo(1u/L)/x(0.5mM))给予0.1mM和0.5mM抗氧化剂tempol共同孵育24小时,同样检测细胞内Shh mRNA表达的变化。以管家基因GAPDH为内参,与单纯氧化应激组相比,不同浓度的tempol分别使心肌细胞内Shh mRNA表达上升7.4% (P0.05)和45.2% (P0.05)。 2.使用黄嘌呤氧化酶/黄嘌呤(xo/x)浓度分别为xo (0.5u/L)/x(0.5mM)和xo(1u/L)/x(0.5mM)作用于心肌细胞24小时后,提取心肌细胞总蛋白,检测细胞内Shh蛋白表达的变化。以管家基因GAPDH蛋白为内参,与正常组对照组相比,不同浓度的xo/x分别使心肌细胞内Shh蛋白表达降低19%和38.6% (P0.05)。另外在氧化应激的基础上(xo(1u/L)/x(0.5mM))给予0.1mM和0.5mM抗氧化剂tempol共同孵育24小时,同样检测细胞内Shh蛋白表达的变化。以管家基因GAPDH蛋白为内参,与单纯氧化应激组相比,不同浓度的tempol分别使心肌细胞内Shh蛋白表达上升0.08% (P0.05)和24.4% (P0.05)。 结论: 氧化应激系统(黄嘌呤氧化酶/黄嘌呤)刺激心肌细胞,导致Shh mRNA和蛋白表达降低,用tempol抗氧化保护可以抑制氧化应激系统造成的Shh mRNA和蛋白表达降低。由此可见,氧化应激直接导致心肌细胞中Shh表达下降。 第二部分小鼠急性心肌梗塞模型的制备 目的: 大量临床研究表明,糖尿病与心力衰竭之间有着独立密切的联系,不仅表现在糖尿病患者同时患心力衰竭的机率远大于非糖尿病患者,还表现在糖尿病患者同时患上心肌梗塞后,其修复速度远小于非糖尿病患者。已有研究表明,在小鼠急性心梗模型中Shh的表达是增加的,且Shh对急、慢性心肌缺血模型以及缺血再灌注损伤模型有显著的修复治疗作用。我们之前的研究已经证实,糖尿病小鼠心肌组织中Shh表达降低,因此,建立小鼠急性心肌梗塞模型可以进一步研究糖尿病小鼠心肌组织中Shh表达降低的意义。 方法: 结扎冠状动脉左前降支制造小鼠急性心肌梗塞模型。心肌梗塞两周后,通过形态学观察、检测左室收缩末内径(LVED;s)、左室舒张末内径(LVED;d)、左室短轴缩短分数(FS%)、射血分数(EF%)、左室收缩期前壁厚度(LVAW;s)、后壁厚度(LVPW;s),左室舒张期前壁厚度(LVAW;d)、后壁厚度(LVPW;d)来确认心肌梗塞模型的成功。 结果: 1.形态学观察:将正常组两周和心梗组两周的心脏取出,经过处理取像后观察左室前壁厚度、颜色和心室腔大小,结果显示心梗组两周的左室前壁变薄、颜色变白,且室腔扩大明显。 2.超声心功能评价:应用实时超声成像系统Vevo770 (Visualsonics)于术前及术后两周行经胸超声检查。结果显示心梗组两周的左室前壁明显变薄,且心室腔明显扩大。心梗组两周的左室收缩期和舒张期前壁厚度(LVAW;s、LVAW;d)、左室射血分数(EF%)、左心室短轴缩短率( FS%)、心输出量(CO)分别比正常组两周时低70%、53.8%、65.15%、71.08%、47.12% (P0.05),左心室收缩末期内径(LVID;s)、舒张末期内径(LVID;d)分别比正常组两周时高67.5%、15.6%(P0.05);心梗组术前与正常组术前上述各指标比较没有明显变化(P0.05)。 结论: 形态学观察结果和超声评价指标均显示按照本实验室条件以及方法确实能有效的形成急性心肌梗塞模型。这为今后继续深入探讨Shh在糖尿病心肌组织中表达降低的意义打下了良好的基础。
[Abstract]:The effect of Part 1 oxidative stress on the expression of Sonic hedgehog (Shh) in neonatal rat cardiac myocytes
Objective:
Hedgehog瀹舵棌鏄�涓�绫诲垎娉屼俊鍙疯泲鐧，

本文编号：1613086