乙酰胆碱、蛙皮素和P物质对人类食管下括约肌张力调节的细胞内信号转导机制

发布时间：2018-03-15 01:35

本文选题：食管下括约肌　切入点：套索纤维　出处：《河北医科大学》2010年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 人食管下括约肌(lower esophageal sphincter, LES)是位于食管和胃交界部的一簇肌肉组织。它不仅可以保证食管内吞咽食物入胃畅通,而且能够阻止胃内容物向食管返流。当食管下括约肌的功能发生障碍时,就会造成食物通过障碍或胃食管返流疾病。对于人食管下括约肌的认识却经历了一个漫长的过程。直到1979年,Liebermann-Meffert等对食管胃连接部(esophago- gastric junction, EGJ)的平滑肌进行详细研究,提出人类食管下括约肌由内层大弯侧的套索纤维(sling fibers)和小弯侧半环形的钩状纤维(clasp fibers)构成,这两束肌肉共同维持LES的关闭状态,并形成了LES高压带(high- pressure zone, HPZ)。这一理论为进一步研究LES的生理、病理和药理学特性奠定了基础。在随后的研究中,学者们对不同动物LES的生理学特点和功能调节进行了较为深入的探讨,发现构成LES的套索纤维和钩状纤维在诸多方面存在着很大的差异性。 Sohn等在对动物LES的研究中发现,在猫的食管环形肌,由乙酰胆碱激动所引起的收缩由与PTX敏感的Gi3蛋白关联的M2型毒蕈碱受体介导,收缩依赖细胞外钙离子内流引发的磷脂酰胆碱特异性磷脂酶D(PC-PLD)的激活、DAG的产生和PKC依赖的信号转导途径。而在猫的食管下括约肌,乙酰胆碱则通过与PTX不敏感的Gq-G11蛋白相关联的M3受体起作用,其下游激活磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC),从而产生IP3并导致胞内钙的释放和钙调蛋白依赖的信号转导途径的激活。 Biancani等在对动物食管下括约肌单细胞的研究中,发现两条独立存在的导致收缩的信号转导通路。一条通路,由PI-PLC,IP3,依赖钙调蛋白的信号转导通路组成,通过最大有效剂量的乙酰胆碱激活。这条通路由M3受体与Gq-G11藕联,从而活化PLC,水解PIP2产生IP3和DAG。IP3导致胞内钙库释放Ca2+,产生钙-钙调蛋白复合体,肌球蛋白轻链磷酸化从而导致收缩。这条途径不依赖于PKC,这是因为钙调蛋白激动后抑制PKC的活性。在维持LES张力时或低于最大有效剂量的乙酰胆碱作用下,激活的则是一条PKC依赖转导通路,在这条通路中,PLC活性处于低水平,产生较少的IP3,从而使得胞内钙库释放较少的Ca2+,低水平的Ca2+不能激活钙调蛋白通路,然而PLC水解PIP2的另一产物DAG与低水平的IP3一起,则可以激活PKC依赖的转导通路。由此可见,钙离子的水平决定了介导食管下括约肌收缩的细胞内信号转导途径,高钙激活钙调蛋白通路,低钙激活PKC通路。乙酰胆碱作为食管下括约肌张力调节的主要神经递质,在人食管下括约肌张力变化调节的过程中,是通过上述哪一条通路起作用,还是两条转导途径都有作用,目前还没有定论。乙酰胆碱引起肌细胞收缩的细胞内信号转导通路是激动剂-受体水平决定,还是因肌细胞部位的不同而不同,现在也不清楚。因此,本研究选取广泛存在于中枢、外周及肠神经系统,对胃肠运动的调节与乙酰胆碱在受体水平不同的蛙皮素和P物质两种脑肠肽作比照,分析人食管下括约肌套索纤维,钩状纤维,食管环形肌和胃底环形肌细胞内信号转导途径,深入探讨构成LES的套索纤维和钩状纤维在细胞水平的异同,揭示两者在食管下括约肌张力变化调节中作用的内在机制。第一部分乙酰胆碱、蛙皮素和P物质对人类食管下括约肌套索纤维和钩状纤维的调节作用 1乙酰胆碱对人类食管下括约肌套索纤维和钩状纤维的调节作用目的:乙酰胆碱是食管下括约肌张力调节的主要神经递质,本文旨在通过研究乙酰胆碱对人食管下括约肌钩状纤维和套索纤维的作用规律,为研究受体后信号转导途径打下工作基础。方法:选取2008年3月至2009年10月在河北医科大学第四医院因食管中段癌行食管大部切除术患者5例,采集套索纤维、钩状纤维、食管体部和胃底部的环行肌组织。制备平滑肌单细胞悬液,利用细胞动缘测量技术和药理学方法,得出各类肌细胞原长和不同终浓度的乙酰胆碱(mol/L: 10-11, 10-10, 10-9, 10-8, 10-7,10-6)作用收缩后的长度。通过软件SPSS 13.0进行统计学分析,得出浓度-反应关系曲线,求出各类肌细胞的最大收缩效应值(Emax)。并得出对应的激动剂浓度。所得数据以均数±标准差(x±s)表示,以P0. 05为差异有统计学意义。结果:在从10-11至10-6mol/L的浓度中,食管下括约肌的钩状纤维、套索纤维及食管环形肌、胃底环形肌四种类型的肌纤维,每种肌细胞均在乙酰胆碱10-9mol/L的浓度时取得最大收缩效应,并且10-9mol/L乙酰胆碱在钩状纤维、套索纤维及食管环形肌、胃底环形肌的收缩百分比分别为21.8±0.9%、23.1±1.9%、22.2±2.0%和21.9±1.2%。钩状纤维、套索纤维及食管环形肌、胃底环形肌组间差异无统计学意义(P0.05)。结论:人类LES的套索纤维和钩状纤维及食管环形肌、胃底环形肌的单个完整细胞对乙酰胆碱的刺激存在浓度依赖效应。在10-9mol/L乙酰胆碱的作用下取得最大收缩。 2蛙皮素和P物质对人类食管下括约肌套索纤维和钩状纤维的调节作用目的:蛙皮素和P物质等脑肠肽广泛存在于中枢、外周及肠神经系统,对胃肠运动的调节与乙酰胆碱在受体水平不同。本文旨在通过研究蛙皮素和P物质对人食管下括约肌钩状纤维和套索纤维的作用规律,为研究受体后信号转导途径打下工作基础。方法:选取2008年3月至2009年10月在河北医科大学第四医院因食管中段癌行食管大部切除术患者5例,采集套索纤维、钩状纤维、食管体部和胃底部的环行肌组织。制备平滑肌单细胞悬液,利用细胞动缘测量技术和药理学方法,得出各类肌细胞原长和不同终浓度的蛙皮素和P物质(mol/L: 10-11, 10-10, 10-9, 10-8, 10-7,10-6)作用收缩后的长度。通过软件SPSS 13.0进行统计学分析,得出浓度-反应关系曲线,求出各类肌细胞的最大收缩效应值(Emax)。并得出对应的激动剂浓度。所得数据以均数±标准差( x±s)表示,以P0. 05为差异有统计学意义。结果:在激动剂从10-11至10-6mol/L的浓度中,食管下括约肌的钩状纤维、套索纤维及食管环形肌、胃底环形肌四种类型的肌纤维,每种肌细胞均在蛙皮素和P物质10-7mol/L的浓度时取得最大收缩效应,并且10-7mol/L蛙皮素引起钩状纤维、套索纤维及食管环形肌、胃底环形肌的收缩百分比分别为23.2±1.1%、23.9±2.1%、23.9±1.2%和24.8±1.9%;10-7mol/L P物质分别为24.1±1.2%、25.8±1.1%、25.1±1.1%和24.3±2.1%,与乙酰胆碱比较,每种肌细胞三种激动剂所引起的最大收缩之间的差异无统计学意义(P0.05)。而钩状纤维、套索纤维及食管环形肌、胃底环形肌之间的差异亦无统计学意义(P0.05)。结论:人类LES的套索纤维和钩状纤维及食管环形肌、胃底环形肌的单个完整细胞对蛙皮素和P物质的刺激存在浓度依赖效应。在10-7mol/L蛙皮素和P物质的作用下取得最大收缩。与乙酰胆碱比较,蛙皮素和P物质能够有效激动这四种肌细胞,取得与乙酰胆碱相近的最大收缩效应。第二部分G蛋白在人类食管下括约肌套索纤维和钩状纤维的表达和功能 1 G蛋白在人食管下括约肌套索纤维和钩状纤维的表达目的:乙酰胆碱、蛙皮素和P物质等激动剂使受体活化后,引起鸟苷酸结合蛋白(GTP-binding protein,G蛋白)的激活,作用于下游效应酶,从而影响胞内信使产生调控效应,介导食管下括约肌细胞的收缩。本文主要阐述G蛋白的四种亚型Gi3,Gq-G11,Go, Gs在人食管下括约肌套索纤维和钩状纤维的表达。方法:收集2008年3月至2009年10月在河北医科大学第四医院因食管中段癌行食管大部切除术患者32例食管下括约肌的钩状纤维和套索纤维,以及食管环形肌和胃底环行肌四组标本。应用蛋白免疫印迹法(western blot)对比各组G蛋白亚型表达水平。结果以目的蛋白条带AU值与内参比较,凝胶成像软件分析结果。采用SPSS16.0统计软件。计量资料以平均值±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析,以P0.05为差异有统计学意义。结果: Western blot的结果显示,Gq/11和Gi3在人食管下括约肌套索纤维钩状纤维以及食管环形肌,胃底环形肌中均为宽条带,Go显示为细条带,Gs大体未见明显条带。凝胶成像软件分析结果:Gs蛋白条带吸光度值测不出,Gq/11的蛋白条带吸光度值(1组(套索纤维组):0.486±0.082;2组(钩状纤维组):0.492±0.109;3组(食管环形肌组):0.417±0.161;4组(胃底环形肌组):0.494±0.101),Go的蛋白条带吸光度值(1组:0.011±0.008;2组:0.016±0.012;3组:0.010±0.007;4组:0.009±0.008),Gi3的蛋白条带吸光度值(1组:0.567±0.101;2组:0.523±0.131;3组:0.590±0.097;4组:0.561±0.147)。组间比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论:人食管下括约肌套索纤维钩状纤维以及食管环形肌,胃底环形肌中G蛋白的表达以Gq/11和Gi3为主,Go弱表达,Gs无表达。各G蛋白亚型表达在人食管下括约肌套索纤维钩状纤维以及食管环形肌,胃底环形肌的组间差异无统计学意义。 2 G蛋白在人食管下括约肌套索纤维和钩状纤维的功能目的:最大有效剂量的乙酰胆碱、蛙皮素和P物质使受体活化后,引起鸟苷酸结合蛋白(GTP-binding protein,G蛋白)的激活,从而引起磷脂酶的活化,胞内信号分子水平的改变,食管下括约肌细胞的收缩。因此阐明介导食管下括约肌收缩过程中与各激动剂受体偶联的G蛋白的类型,对进一步研究受体后信号转导通路具有重要意义。方法:收集2008年3月至2009年10月在河北医科大学第四医院因食管中段癌行食管大部切除术患者32例食管下括约肌的钩状纤维和套索纤维,以及食管环形肌和胃底环行肌四组标本。制备破膜平滑肌单细胞悬液,利用细胞动缘测量技术和药理学方法,以乙酰胆碱、蛙皮素和P物质作为激动剂,选用一组特异性G蛋白抗体,对比不同亚型G蛋白抗体对各组肌细胞收缩的抑制情况,通过软件SPSS 16.0进行统计学分析,所得数据以均数±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析,以P0.05为差异有统计学意义,分析受体偶联的G蛋白类型。结果: 32例标本中,Gi3抗体对食管环形肌组和钩状纤维组的抑制作用明显强于Go,Gq/11和空白对照(P0.001),说明在食管环形肌和钩状纤维,乙酰胆碱、蛙皮素和P物质引起的收缩依赖于G蛋白的Gi3亚型; Gq/11抗体对套索纤维和胃底环行肌组的抑制作用强于Go,Gi3和空白对照(P0.001),说明在套索纤维和胃底环行肌,乙酰胆碱、蛙皮素和P物质引起的收缩依赖于G蛋白的Gq/11亚型。结论:在以乙酰胆碱或蛙皮素、P物质作激动剂的试验中,食管环形肌和钩状纤维的收缩依赖于G蛋白的Gi3亚型。胃底环行肌和套索纤维的收缩依赖于G蛋白的Gq/11亚型。三种激动剂受体耦联的G蛋白类型具有肌细胞类型特异性和单一性的特点。Gi3和Gq/11分别在食管环形肌,钩状纤维和胃底环行肌,套索纤维离体细胞收缩过程中有重要作用。第三部分磷脂酶在人类食管下括约肌套索纤维和钩状纤维收缩过程中的作用目的:细胞外的激动剂和胞膜上的相应受体结合,激活相应的G蛋白后,需要细胞脂质池的水解,从而产生第二信使,将胞外的信号转化为细胞内信号,到达效应器,并最终形成细胞收缩动作。在这个过程当中,磷脂酶对于催化水解细胞脂质池起到了关键的作用,那么在研究的四种肌纤维中,激动剂的调节效应究竟是哪类磷脂酶活化并起到产生第二信使作用的,目前尚不清楚。本研究目的在于探讨磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C,磷脂酰胆碱特异的磷脂酶C及磷脂酰胆碱特异的磷脂酶D在人食管下括约肌收缩过程中的作用规律。方法:选取2008年3月至2005年10月在河北医科大学第四医院因高位食管中段癌行食管大部切除术患者5例,分离食管下括约肌套索纤维、钩状纤维和胃底环形肌、食管环形肌,制备单细胞悬液,皂苷作用制备破膜细胞,运用细胞动缘测量技术和药理学方法,观察磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C的抑制剂U-73122(10-6M)、磷脂酰胆碱特异的磷脂酶C的抑制剂D609(10-4M)、磷脂酰胆碱特异的磷脂酶D的抑制剂普奈洛尔(10-4M)及D609、普奈洛尔合用四种方法处理对激动剂乙酰胆碱、P物质和蛙皮素收缩反应的抑制效应,用所占在无拮抗剂存在时细胞对激动剂的反应强度的百分比表示。以空白做对照。使用抑制剂U-73122,普奈洛尔和D609时,细胞在适当浓度的抑制剂中孵育5分钟后加入激动剂,抑制剂的使用浓度为其最大有效浓度。再应用细胞动缘学技术测定对四种肌细胞收缩的抑制情况。结果: (1)PI-PLC的抑制剂U-73122作用时,对钩状纤维和食管环形肌细胞收缩的抑制程度较小,对套索纤维和胃底环形肌的抑制较明显。而钩状纤维,食管环形肌分别与套索纤维以及胃底环形肌比较,组间差异有统计学意义(p0.05)。实验结果说明PI-PLC在乙酰胆碱、P物质和蛙皮素引起的套索纤维和胃底环形肌的收缩中起重要作用。(2)PC-PLC的抑制剂D609作用时,与PI-PLC的抑制剂U-73122相反,对套索纤维和胃底环形肌细胞收缩的抑制程度较小,对钩状纤维和食管环形肌的抑制较明显,而套索纤维,胃底环形肌分别与钩状纤维以及食管环形肌比较,组间差异有统计学意义(P0.05)。实验结果说明PC-PLC在乙酰胆碱、P物质和蛙皮素引起的钩状纤维和食管环形肌的收缩中起重要作用。(3)PLD的抑制剂普奈洛尔作用时,对套索纤维和胃底环形肌细胞收缩的抑制程度较小,对钩状纤维和食管环形肌的抑制较明显,而套索纤维,胃底环形肌分别与钩状纤维以及食管环形肌比较,组间差异有统计学意义(P0.05)。(4)D609和普奈洛尔合用时,对钩状纤维收缩的抑制与D609和普奈洛尔单独作用时比较(P=0.014,P=0.027),具有明显的叠加效应。结论:乙酰胆碱,蛙皮素和P物质在套索纤维,胃底环形肌和钩状纤维,食管环形肌引起的收缩,活化的磷脂酶不同。抑制PI-PLC对套索纤维和胃底环形肌的收缩有抑制作用,抑制PC-PLC或PC-PLD对钩状纤维和食管环形肌的收缩有抑制作用,且两者共同作用具有叠加效应,几乎完全抑制钩状纤维和食管环形肌的收缩。第四部分钙调蛋白信号通路和蛋白激酶C信号通路在人食管下括约肌中的作用目的:PKC信号通路和钙调蛋白信号通路作为重要的细胞内信号转导途径,介导许多不同部位消化道平滑肌的收缩,是多种平滑肌细胞膜受体与相应的激动剂配体结合后启动,进而诱导肌细胞产生收缩效应的重要信号通路。本文旨在探讨蛋白激酶C(PKC)和钙调蛋白两条信号转导通路在人食管下括约肌钩状纤维和套索纤维收缩机制中的作用,并同时比较两种肌纤维与食管环形肌、胃底环形肌收缩机制的异同。方法:选取2008年3月至2009年10月在河北医科大学第四医院因食管中段癌行食管大部切除术患者5例,采集套索纤维、钩状纤维、食管体部和胃底部的环行肌组织。制备平滑肌单细胞悬液,利用细胞动缘测量技术和药理学方法,分别应用PKC信号通路特异性阻断剂H7、无钙培养、钙调蛋白信号通路特异性阻断剂CGS9343B和以4mmol/L锶离子代替钙离子以阻断内源性钙离子的释放四种方法预处理后,加入激动剂,再测定对四种肌细胞收缩的抑制情况。结果:无钙溶液可以阻断乙酰胆碱、蛙皮素和P物质诱导的钩状纤维和食管环形肌细胞的收缩,但对套索纤维和胃底环形肌收缩抑制不显著(P0.05);以4mmol/L的锶离子代替胞外钙离子的方法,可以阻断乙酰胆碱、蛙皮素和P物质诱导的套索纤维和胃底环形肌细胞的收缩,但对钩状纤维和食管环形肌收缩抑制没有明显的影响(P0.05);PKC信号通路特异性阻断剂H7明显抑制乙酰胆碱、蛙皮素和P物质诱导的钩状纤维和食管环形肌细胞的收缩,但对套索纤维和胃底环形肌收缩的抑制不明显(P0.05);钙调蛋白信号通路特异性阻断剂CGS9343B可明显抑制乙酰胆碱、蛙皮素和P物质诱导的套索纤维和胃底环形肌细胞的收缩,但对钩状纤维和食管环形肌细胞的收缩没有显著影响(P0.05)。结论:钙调蛋白信号通路在介导套索纤维肌细胞收缩过程中起重要作用,而PKC信号通路在介导钩状纤维肌细胞收缩过程中起重要作用,两者分别需要细胞内源性钙离子的释放与细胞外钙离子的内流。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R333

【参考文献】