人类胚胎干细胞X染色体倾斜性失活及印迹、X连锁基因表达状态

发布时间：2018-03-15 09:21

本文选题：人类胚胎干细胞　切入点：核型　出处：《广州医学院》2009年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 人类胚胎干细胞(hESC)因具有自我更新并分化成为三个胚层不同类型细胞的潜能,在再生医学和细胞替代治疗中具有重要的作用。体外培养过程中遗传和表观遗传的稳定是评价hESC治疗前景的重要条件。尽管对hESC分化过程中的遗传改变已有所了解,但对其表观遗传变化却依然知之甚少。本研究利用表观遗传修饰的一个重要组成部分--X染色体失活(XCI)及印迹、甲基化现象,通过甲基化特异性PCR、荧光实时定量PCR、免疫荧光染色等方法,对hESC的表观遗传调控机制进行了初步研究,对其XCI、相关印迹基因和部分X连锁基因的表达状态进行了分析。对本实验室建立的六株女性hESC的研究表明,和小鼠胚胎干细胞XCI状态不一样,hESC在未分化阶段就已出现了X染色体失活。正常二倍体hESC在分化后能稳定的保持XCI状态。同时本研究发现,五株杂合子hESC的XCI具有两种不同的状态:四株hESC具有极度倾斜性XCI状态,一株hESC的XCI却是随机的。有意思的是,对三倍体hESC (核型69,XXX)的研究发现,这种细胞具有两条活性X染色体,其XCI状态随着体外的长时间培养发生了变化。对印迹基因及X连锁基因的研究表明,hESC能维持正常的表达状态。本研究还对一株人类孤雌胚胎干细胞(hpESC)的以上特性进行了探讨,发现这种细胞具有遗传和表观遗传的不稳定性。本研究表明,在安全应用hESC于再生医学前,必须进行更深入的表观机制及细胞功能分析。第一部分人类受精卵来源胚胎干细胞的培养及其生物学特征鉴定【研究目的】对前期利用废弃的低质量胚胎建立的hESC系进行培养,为后续研究提供实验材料。对所建立hESC系进行干细胞特性鉴定,掌握不同细胞系的生物学特性。【材料方法】 1、利用本实验室前期建立的hESC系,体外培养传代。进行hESC表面抗原SSEA-1,SSEA-4, TRA-1-60,TRA-1-81等染色鉴定。 2、每隔10代进行一次染色体核型鉴定,每次计数20个分裂像。 3、体外培养保持未分化状态,收集不同代次间的细胞,提取基因组DNA和总RNA。 4、对以上细胞体外进行自体分化,分别收集分化第零天及第三、七和第二十天的细胞,提取基因组DNA和总RNA。 5、RT-PCR反应检测经典的Ⅰ类未分化分子标记物基因的表达情况。 6、体内外分化能力检测:悬浮培养hESC细胞,形成拟胚体,进行分化标记物基因RT-PCR检测;将hESC团块接种到SCID小鼠的腹股沟皮下,观察是否有肿瘤生长。 7、对各株hESC细胞进行16个STR位点鉴别。【结果】 1、核型分析,四株hESC为正常核型:46, XX (FY-hES-7,-8,-10,-11);一株为平衡易位13三体核型(FY-hES-5):46, XX,+13,der(13;13) (q10;q10);一株为三倍体细胞(FY-3PN):69,XXX。 2、六株hESC系均具有典型的hESC克隆形态,表达hESC细胞表面抗原SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81;不表达SSEA-1。 3、经典的Ⅰ类未分化分子标记物基因OCT4,NANOG,TDGF1,SOX 2,EBAF, THY-1,FGF4,REX-1等在六株hESC系中均表达阳性。 4、六株hESC系均具有体外自发分化形成囊性拟胚体的能力,分化标记物基因AFP,NEUROD1,HBZ等表达阳性。六株hESC均能形成畸胎瘤。 5、每株hESC系的STR图谱都不一样,证明其来自于不同的胚胎。【结论】 1、采用本实验室最佳培养体系,确保各细胞具有相同的培养条件,为后续实验提供可靠的细胞资源。 2、六株hESC系在体外长期传代中,能够维持hESC细胞的生物学特性,具有自我更新、分化的能力。 3、STR位点分析用于hESC系的鉴定,可以为其提供相应的“身份证”,区分不同的细胞株,为干细胞将来的临床应用建立完善的档案资料。 4、利用废胚的胚胎进行hESC细胞的建系,可能导致异常核型干细胞的产生。核型分析证实罗伯逊易位和三倍体的hESC在体外培养过程中没有发生自我修复的现象,能保持遗传性质的稳定。第二部分人类胚胎干细胞X染色体失活及印迹、X连锁基因表达状态第一章正常与异常核型人类胚胎干细胞X染色体失活状态分析【研究目的】以XCI为重点,对正常与异常核型人类受精卵来源hESC在自我更新与分化过程中的表观遗传调控机制进行研究,初步了解正常与异常核型hESC在体外培养过程中的XCI状态,并探讨异常核型hESC的XCI状态与正常核型hESC的异同。【材料方法】 1、对各细胞DNA进行人雄激素受体基因(HUMARA)多态性片断分析,判断其纯合性,选择HUMARA基因杂合子进行XCI倾斜性分析。 2、使用EpiTect Bisulfite Kit试剂盒(QIGEN),将基因组DNA进行用重亚硫酸盐处理,随后行引物特异性PCR反应,并对产物进行多态性片段分析。 3、实时荧光定量PCR检测XCI相关基因XIST在不同时期的表达情况。 4、细胞低密度种于四孔板内,保持未分化状态,行组蛋白H3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)免疫荧光染色(Cell Signaling, USA)。【结果】 1、正常核型细胞中,三株细胞HUMARA位点为杂合子,一株细胞为纯合子。二株异常核型的女性hESC的HUMARA位点也为杂合子。三倍体细胞HUMARA位点表现出三个不同的位点。 2、对六株hESC的XCI失活分析表明,所有细胞在未分化阶段均已开始启动XCI。 3、对五株HUMARA位点杂合子的hESC进行XCI倾斜性失活分析,四株细胞具有极度倾斜性失活状态,一株细胞表现为随机失活状态。失活状态在细胞分化后可以稳定的维持。三倍体细胞具有两条活性X染色体,失活状态在体外长期培养过程中发生了变化,从随机失活逐渐变为极度倾斜性X失活。 4、XIST基因伴随XCI的出现在未分化阶段已可检出。在不同的分化时期,不同的细胞系有不同的XIST基因的表达情况。 5、组蛋白H3K27三甲基化免疫荧光染色证实未分化状态细胞的确启动了XCI。【结论】 1、基于HUMARA的甲基化特异性PCR是研究hESC倾斜性XCI的一个好方法。 2、hESC的XCI具有两种不同的类型:一种为极度倾斜性失活,一种为随机失活。 3、和小鼠胚胎干细胞不同,hESC在未分化阶段就已开始启动XCI。正常核型二倍体hESC的倾斜性或随机XCI可以在细胞传代、分化过程中保持稳定。 4、分化前后XIST基因表达的变化表明不同的hESC表达XCI标记的能力不一致。大部分细胞系在分化前启动了XCI,但在分化过程中逐渐完成XCI。 5、H3K27me3表达证实未分化细胞的确进行了XCI。 6、异常核型hESC具有和正常hESC相似的XCI状态,在未分化阶段已启动XCI。 7、体外培养条件也许能影响三倍体hESC的XCI稳定性,导致倾斜性XCI的发生。 8、三倍体细胞因为具有三条X染色体,在进行X失活时,由于只有一条倾斜性失活,而另两条则全为活性,这将导致其比正常细胞多一倍的基因表达活性,这可能是三倍体胚胎容易流产的一个表观遗传学原因。第二章人类胚胎干细胞印迹基因及X连锁基因表达和启动子区域DNA甲基化状态研究【研究目的】对具有倾斜性XCI的hESC的X连锁基因PGK1、X染色体上抑癌基因及癌症基因和常染色体印迹基因的表达情况分析,研究这些基因是否随着X染色体的倾斜性失活而发生变化。检测X染色体及常染色体上重要基因的启动子区域DNA甲基化状态随着细胞分化是否产生改变。【材料方法】 1、实时荧光定量PCR检测X连锁基因PGK1、X染色体上抑癌基因RBBP7及癌症基因GPC4在不同时期的表达情况。 2、选取常染色体上父系印迹基因H19、IGF2R,母系印迹基因SNRPN进行实时荧光定量PCR检测,比较不同时期、不同核型对印迹基因的影响情况。 3、实时荧光定量PCR检测正常和异常核型hESC体外自体分化过程中,多能性调控基因OCT4、NANOG的表达情况。 4、将不同细胞不同时期的基因组DNA进行重亚硫酸盐处理,随后行引物特异性PCR反应。凝胶电泳分析产物。【结果】 1、正常和异常核型hESC的PGK1基因随着分化时间的增加呈现上调表达的趋势。 2、异常核型hESC抑癌基因RBBP7及癌症基因GPC4随着分化时间的增加呈现上调表达的趋势,而在正常核型hESC中则下调。 3、正常和异常核型hESC中印迹基因表达基本一致:父系印迹基因H19、IGF2R上调而母系印迹基因SNRPN表达则下调。 4、正常核型hESC随着分化时间的增加,多能性调控基因OCT4、NANOG表达明显下降,而异常核型hESC中OCT4、NANOG则下降相对没有正常细胞显著。 5、正常和异常核型胚胎干细胞XIST基因、SNRPN基因在未分化状态可检出甲基化和未甲基化两种状态,并能在体外分化过程中保持稳定。【结论】 1、X连锁基因PGK1、印迹基因在正常和异常核型hESC中表达基本一致,证明检测基因在hESC的发育过程中能维持正常调节。 2、正常和异常核型干细胞XIST基因、SNRPN基因启动子区域有正常的DNA甲基化状态,并能随着细胞分化维持稳定的甲基化状态。 3、异常核型hESC抑癌基因、癌症基因表达相对正常核型hESC的增加表明此种细胞具有更危险的应用前景,同时多能性基因在分化后仍能检出表明此种细胞分化能力较正常细胞弱。第三部分孤雌人类胚胎干细胞的遗传和表观遗传稳定性初步研究【研究目的】 1、培养本实验室建立的一株人孤雌胚胎干细胞(hpESC) ,并在其培养过程中进行核型分析,了解这种细胞的遗传稳定性。 2、对父系基因缺乏的hpESC的XCI状态、印迹基因、多能性调控基因表达情况进行研究,了解其表观遗传学特性及相关生物学特性。【材料方法】 1、体外培养hpESC,与捐卵者DNA比较,检测其STR、HLA,证实其孤雌来源。 2、每10代进行一次核型分析,每次计数20个分裂像。 3、提取孤雌细胞DNA进行HUMARA多态性片断分析。 4、将基因组DNA进行重亚硫酸盐处理并行引物特异性PCR反应。 5、选取常染色体上父系印迹基因H19,母系印迹基因SNRPN、IGF2进行PCR检测。 6、实时荧光定量PCR检测hpESC体外自体分化中多能性调控基因OCT4的表达。【结果】 1、与志愿捐卵者DNA比较,其STR、HLA均为纯合子,与志愿者DNA半匹配,证实其的确是孤雌细胞。 2、核型的不稳定:在第20代核型为46,XX,第30-50代为46,XX/45,X嵌合体,到了第60代后又恢复为46,XX核型。 3、HUMARA基因多态性分析表明,hpESC此基因位点为纯合子。 4、对hpESC进行XCI分析,其在第20代没有检出失活的X染色体,表明其为双活性X染色体。到了第60代后,其进行了XCI,一条X为活性的,另一条X为失活的,但由于其为纯合子,不能分析其是否具有倾斜性失活状态。 5、XIST基因在早期不表达。长期培养后,伴随XCI的发生,XIST基因表达可检出。 6、hpESC母系印迹基因SNRPN、IGF2没有表达。 7、多能性调控基因OCT4在hpESC分化后仍可检出,与其分化能力弱有一定联系。【结论】 1、本实验室建立的珍贵细胞的确是人孤雌胚胎干细胞。 2、纯合子hpESC在体外培养中其遗传学特性不稳定。 3、X失活研究表明,hpESC早期是双活性,这可能是其X染色体不稳定的原因之一。在培养过程中,其X染色体进行了选择和修复,并最终发生了XCI。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R321

【参考文献】