两株抗JEV单抗可变区的基因克

发布时间：2018-03-19 09:16

本文选题：日本脑炎病毒　切入点：E蛋白　出处：《第四军医大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：日本脑炎病毒（JEV）是黄病毒科、黄病毒属主要成员，病毒通过蚊子叮咬传播，可引起人类急性中枢神经系统传染性疾病日本脑炎（我国也称流行性乙型脑炎，简称乙脑），主要发病人群为儿童，重症病死率较高，近三分之一的幸存者留有各种各样的神经系统后遗症，仍然严重威胁公众健康。随着全球气候暖化，日本脑炎病毒的流行地域也不断扩大，成为全球性的公共卫生问题。 JEV E蛋白是病毒主要的结构蛋白之一，参与病毒吸附、穿入，与其致病性密切相关。本课题组制备了两株具有高中和活性的抗JEV单克隆抗体（2H4和2F2），并在多种感染动物模型上证实了其显著的被动保护作用，但抗体与JEV相互作用的机制尚未完全阐明。因此，本研究利用分子生物学方法获得2H4和2F2抗体可变区基因，原核表达并纯化了2H4和2F2重链可变区，确认了原核表达的重链可变区产物与JEV的结合活性，利用计算机软件构建了2H4和2F2可变区的空间模型，再与已有的JEV E蛋白空间模型进行了模拟分子对接，了解了对抗体结合活性有重要影响的关键氨基酸，为最终阐明抗体中和作用机制奠定了实验基础。具体研究内容和结果如下： 1.确定了2H4、2F2可变区基因培养2H4、2F2杂交瘤细胞，经RNA提取试剂RNAiso Plus提取细胞总RNA。根据GenBank中鼠免疫球蛋白可变区基因序列，设计出分别针对FR1和FR4的上、下游引物，以总RNA为模板扩增2H4、2F2可变区基因。进行了2H4、2F2重链和轻链可变区基因核苷酸序列同源性分析（BLASTN，此过程在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中进行），并用IMGT/V-QUEST分析了可变区结构，确定了2H4、2F2单抗可变区CDR和FR。结果显示，这些序列包含典型的CDR1、CDR2和CDR3区域以及FR1～FR4区域，完全符合鼠源性IgG抗体可变区基因的特征。2H4、2F2轻链可变区基因均长321bp，编码107个氨基酸，第92位含一个半胱氨酸，并且序列完全相同。2个重链可变区基因序列长354bp，，编码118个氨基酸，第22位和第96位含有维持抗体结构的半胱氨酸。 2.原核表达了2H4、2F2重链可变区并确认了与JEV的结合活性为了便于纯化，选用pRSET A载体。2H4、2F2重链可变区表达产物经镍离子亲和层析纯化、透析，间接ELISA实验证实2H4、2F2重链可变区表达产物可与JEV结合。 3.2H4、2F2单抗可变区的同源建模根据2H4、2F2可变区基因，利用BLASTP软件（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTP）在蛋白质数据库（PDB）中搜索相关蛋白，获得了单抗可变区的同源蛋白，完成了氨基酸序列同源性分析。利用软件MODELLER9v1，以同源蛋白为模板对单抗可变区的主链、侧链进行结构建模，组装出完整的2H4、2F2单抗可变区三维结构模型，再对初始结构模型进行了一系列分子动力学优化，最终获得了单抗可变区三维结构的能量最低构象。 4.2H4、2F2单抗可变区与JEV E蛋白的模拟分子对接利用Discovery Studio v2.1软件模拟了单抗可变区与E蛋白的分子对接，结果显示：E蛋白上与2H4单抗可变区作用的氨基酸位点有5个，分别是16位丝氨酸、37位天冬氨酸、353位精氨酸、375位谷氨酸和378位苯丙氨酸残基；2F2单抗可变区作用则有9个，分别是13位谷氨酸、16位丝氨酸、37位天冬氨酸、300位苏氨酸、336位赖氨酸、347位天冬氨酸、354位亮氨酸、387位精氨酸和388位甘氨酸残基。在所有位点中，13位谷氨酸、16位丝氨酸、37位天冬氨酸和300位苏氨酸在E蛋白结构域Ⅰ区内，其余均在已报道过的E蛋白结构域Ⅲ区内。2H4、2F2单抗同时识别的16位丝氨酸和37位天冬氨酸可能是结构域Ⅰ区中和表位的关键氨基酸所在。2F2的13位谷氨酸和300位苏氨酸也未曾报道。2H4的353位精氨酸未见报道，但375位谷氨酸和378位苯丙氨酸与2F2的387位精氨酸和388位甘氨酸均位于优势中和抗原表位集中的结构域Ⅲ区内。2F2的336位赖氨酸与报道过的337位中和表位非常接近，354亮氨酸未见报道。2F2的作用位点多于2H4，也符合2F2中和活性高于2H4的特性。病毒血凝活性可能与2H4识别的353位精氨酸有关。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373.31

【参考文献】