糖基转移酶Glt25D2克

发布时间：2018-03-23 11:41

  本文选题：糖基化修饰　切入点：糖基转移酶　出处：《山西医科大学》2009年硕士论文

【摘要】： 目的: 本研究旨在解决以下问题: 1.构建糖基转移酶Glt25D2新基因的原核表达载体,诱导融合蛋白表达,并对其进行纯化,制备融合蛋白多克隆抗体。 2.明确该糖基转移酶在肝细胞内的表达定位。 3.该糖基转移酶与HBV LHBs之间可能的关系。 4.该糖基转移酶表达对LHBs表达可能的影响。 5.原核表达蛋白的供体底物特异性分析。 方法: 1.应用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription PCR,RT-PCR)技术,以人肝母瘤细胞系HepG2细胞提取的总RNA为模板,合成cDNA,再以此cDNA为模版扩增目的基因Glt25D2的全长CDs,克隆至pGEM-T-EASY载体,测序正确后将目的基因插入原核表达载体pET32a中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导融合蛋白表达,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析、免疫印迹(Western blot)分析证实融合蛋白表达的特异性。大量诱导该蛋白表达后,利用亲和层析法对表达蛋白进行纯化及柱上复性。 2.纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗Glt25D2融合蛋白的多克隆抗体。以纯化的融合蛋白为抗原,同时以免疫前后的兔血清作为一抗,利用Western blot技术和ELISA方法对多克隆抗体进行特异性分析和效价检测。 3.利用激光共聚焦技术观察Glt25D2在细胞内的分布特征,以及与LHBs之间的可能共定位关系。 4.利用免疫共沉淀技术来验证Glt25D2与LHBs之间可能的相互作用。 5.通过哺乳动物双杂交技术来验证Glt25D2与HBV-LHBS在细胞内的相互作用关系。 6.利用RNAi技术,观察下调Glt25D2表达对LHBs表达可能的影响。构建RNAi干扰质粒,转染HepG2细胞,96小时后收获细胞,提取总RNA,通过实时荧光定量PCR技术筛选有效序列;用有效序列转染HepG2.215细胞,通过流式细胞分选仪分选转染阳性细胞,通过实时荧光PCR定量分析GLT25D2基因沉默后对LHBs的影响。 结果: 1.人肝母瘤细胞系HepG2经10%小牛血清DMEM培养36h后,Trizol法从HEPG2细胞中提取总RNA。行1%琼脂糖凝胶电泳显示目的条带:28s RNA、18s RNA和5s RNA。经RT-PCR扩增获得人肝母瘤细胞cDNA。 2.成功构建Glt25D2的原核表达载体pET32a-Glt25D2,转化BL21表达菌,IPTG诱导表达Glt25D2融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot分析得到证实; 3.纯化Glt25D2融合蛋白并成功制备兔抗Glt25D2多克隆抗体。ELISA检测证实该抗体效价＞1:2560000,Western blot检测证明该抗体有较好的特异性。 4.分别构建真核表达质粒pEGFP-C1-Glt25D2、内质网出口蛋白ERgic-53真核表达质粒pDsRED-N1-ERgic-53,共转染HepG2细胞。激光共聚焦显示Glt25D2与ERgic-53存在共定位现象,提示该糖基转移酶定位于内质网。 5.Glt25D2与LHBs之间的相互作用:成功构建真核表达质粒pACT-Glt25D2及pBIND-LHBs。通过哺乳动物双杂交技术,免疫共沉淀技术证实Glt25D2与HBV包膜蛋白在细胞内有相互作用。激光共聚焦观察显示,Glt25D2与LHBs之间存在明确的共定位现象。 6.利用Biacore体外分子相互作用分析仪,证实Glt25D2具有较强的钙离子结合活性及一定的唾液酸结合活性。 7.成功构建shRNA干扰质粒,并筛选出最有效的shRNA表达质粒,转染HepG2.2.15细胞,通过流式细胞分选仪分选转染阳性细胞,通过实时荧光定量PCR证实Glt25D2基因表达下调后,LHBs mRNA表达相应下调。 结论: 1.Glt25D2原核表达融合蛋白分子量90 kDa。 2.免疫试验动物制备的Glt25D2蛋白多克隆抗体具有较高的Glt25D2结合活性。 3.Glt25D2与ERgic-53内质网出口蛋白存在共定位关系,提示Glt25D2定位于内质网。 4.体外原核表达的Glt25D2融合蛋白具有钙离子结合活性和特异性唾液酸结合活性,提示该酶可能是一个催化蛋白质O-糖基化修饰的糖基转移酶,可能具有唾液酸基转移酶活性。 5.以下证据证实Glt25D2可能是催化HBV包膜蛋白LHBs O-糖基化修饰的糖基转移酶:(1)激光共聚焦技术证实Glt25D2与LHBs存在共定位关系;(2)免疫共沉淀技术证实Glt25D2与LHBs之间存在相互作用;(3)哺乳类动物双杂交技术证实Glt25D2与LHBs之间存在相互作用。 6.Glt25D2表达下调对HepG2.2.15细胞LHBs mRNA表达有负调节作用,提示该酶可能与HBV包膜蛋白的O-糖基化修饰有关。该结论与免疫共沉淀及哺乳类动物双杂交的结果一致,提示该糖基转移酶可能是一个与HBV包膜大蛋白的O-糖基化修饰有关的糖基转移酶。
[Abstract]:Objective:
The purpose of this study is to solve the following problems:
1. the prokaryotic expression vector of the new glycosyltransferase Glt25D2 gene was constructed, and the fusion protein was induced and purified to prepare the polyclonal antibody of the fusion protein.
2. the expression of the glycosyltransferase in the liver cells was clearly defined.
3. the possible relationship between the glycosyltransferase and HBV LHBs.
4. the expression of glycosyltransferase may affect the expression of LHBs.
The specificity analysis of donor substrate of 5. prokaryotic expression protein.
Method:
1. application of reverse transcriptase polymerase chain reaction (Reverse transcription PCR RT-PCR) technology, with the total RNA of HepG2 cells from human liver tumor cell line parent as template for synthesis of cDNA, then cDNA full-length CDs template Glt25D2 amplification of the gene, cloned into pGEM-T-EASY vector, sequenced correctly after the gene was inserted into prokaryotic expression vector pET32a, transformed into Escherichia coli BL21 (DE3), induced by IPTG fusion protein expression, and by twelve sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis (Western blot), Western blot analysis confirmed the specificity of fusion protein expression. The expression of a large number of induction, affinity chromatography purification and renaturation of column the expression of protein utilization.
The 2. purified fusion protein immunizing New Zealand rabbit polyclonal antibody to Glt25D2 fusion protein. The purified fusion protein as antigen to immune rabbit serum before and after at the same time as the first antibody to polyclonal antibody specificity analysis and titer detection using Western blot technique and ELISA method.
3. the laser confocal technique was used to observe the distribution of Glt25D2 in the cells and the possible co localization relationship with LHBs.
4. the possible interaction between Glt25D2 and LHBs was verified by immunoprecipitation.
5. the intercellular interaction between Glt25D2 and HBV-LHBS was verified by mammalian double hybridization.
6. the use of RNAi technology, observe the down-regulation of Glt25D2 expression may influence on LHBs. RNAi plasmid was constructed and transfected into HepG2 cells. After 96 hours the cells were harvested, total RNA extraction, screening effective sequences by real-time quantitative PCR technology; effective sequence was transfected into HepG2.215 cells by flow cytometry sorting through transfection positive cells. Real time fluorescence quantitative analysis of PCR GLT25D2 gene silencing effect on LHBs.
Result:
The 1. human hepatoma cell line HepG2 was cultured with 36h after 10% calf serum DMEM. Trizol was used to extract total RNA. from HEPG2 cells. 1% agarose gel electrophoresis showed the target bands: 28s RNA, 18S RNA and 5S 18S.
2., we successfully constructed the prokaryotic expression vector pET32a-Glt25D2 of Glt25D2, transformed BL21 expression bacteria, and IPTG induced the expression of Glt25D2 fusion protein, which was confirmed by SDS-PAGE and Western blot analysis.
3. purified Glt25D2 fusion protein and successfully prepared Rabbit anti Glt25D2 polyclonal antibody..ELISA test confirmed that the titer of the antibody was > 1:2560000, and Western blot detection showed that the antibody had good specificity.
4., we constructed eukaryotic expression plasmid pEGFP-C1-Glt25D2, the eukaryotic expression plasmid pDsRED-N1-ERgic-53 of endoplasmic reticulum export protein, and co transfected HepG2 cells. Confocal laser scanning showed a co localization phenomenon between Glt25D2 and ERgic-53, suggesting that the glycosyltransferase was located in the endoplasmic reticulum, ERgic-53.
The interaction between 5.Glt25D2 and LHBs: the eukaryotic expression plasmids of pACT-Glt25D2 and pBIND-LHBs. by mammalian two hybrid system was successfully constructed, and confirmed that the Glt25D2 technology of HBV envelope protein interactions in cells co immunoprecipitation. Laser confocal microscopy showed that there were clear positioning phenomenon between Glt25D2 and LHBs.
6. using Biacore in vitro molecular interaction analyzer, it was proved that Glt25D2 had strong calcium binding activity and certain sialic acid binding activity.
7., we successfully constructed the shRNA interference plasmid, and screened the most effective shRNA expression plasmid, transfected HepG2.2.15 cells, and transfected positive cells by flow cytometry. After real-time Glt25D2 expression was confirmed, the expression of LHBs mRNA was down regulated after downregulation of Glt25D2 gene expression.
Conclusion:
1.Glt25D2 prokaryotic expression of fusion protein molecular weight 90 kDa.
The Glt25D2 protein polyclonal antibody prepared by 2. immune test animals has high Glt25D2 binding activity.
There is a co localization relationship between 3.Glt25D2 and ERgic-53 endoplasmic reticulum outlet proteins, suggesting that Glt25D2 is located in the endoplasmic reticulum.
Glt25D2 4. in vitro prokaryotic expression of fusion protein with calcium ion binding activity and specificity of sialic acid binding activity, suggesting that the enzyme is a O- protein glycosylation catalyzed glycosylation transferase, may have sialyl transferase activity.
5. the following evidence that Glt25D2 may be a glycosyl catalyzed HBV envelope protein LHBs O- glycosylation transferase: (1) laser scanning confocal microscopy confirmed that Glt25D2 and LHBs are Co located; (2) the interaction between Glt25D2 and LHBs confirmed by immunoprecipitation; (3) mammalian animal hybrid technology confirmed the interaction between Glt25D2 and LHBs.
6.Glt25D2 expression has a negative regulatory effect on HepG2.2.15 cells LHBs mRNA expression, suggesting that the enzyme may O- glycosylation and HBV envelope protein. The conclusion and co immunoprecipitation and mammalian two hybrid animal results, suggesting that the glycosyltransferases may be O- glycosylation HBV a large envelope protein the modification of glycosyl transferase related.

【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R346

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本文编号：1653310