IFN-诱导的p47 GTP酶在日本血吸虫急性感染中的作用研究

发布时间：2018-03-24 16:21

本文选题：日本血吸虫　切入点：IFN-诱导的p47　出处：《南京医科大学》2008年硕士论文

【摘要】： 目前,血吸虫病防治面临的棘手问题之一在于再感染难以控制,人们一直期待采用人用疫苗作为化疗重要的补充手段进行疾病控制,因此,血吸虫感染宿主的免疫应答规律作为疫苗研制的免疫学基础受到更多关注。然而长期以来,疫苗研制的理论基础一直成为众多学者有争议的焦点。传统意义上的以激发Th2型免疫应答(以IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等细胞因子分泌为主,主要介导体液免疫)的血吸虫病疫苗,主要采用特异性抗体筛选优势抗原,所诱导的保护力往往并不理想。目前更多的证据支持Th1型免疫应答(以IFN-γ分泌为主,主要介导细胞免疫)作为抗血吸虫感染的保护性效应机制。曼氏血吸虫感染小鼠模型中细胞因子的动态变化结果显示,在童虫移行并发育成熟过程中,淋巴细胞主要产生针对童虫或成虫抗原的IFN-γ;随着组织中虫卵的沉积(感染后5w),细胞因子表达谱逐渐发生了改变,到感染后8w,主要以高水平的IL-4、IL-5为主,IFN-γ水平较低,提示在感染早期,IFN-γ可能发挥重要的作用;在虫卵沉积后,宿主的免疫应答出现由Th1型向Th2型的漂移。本实验室前期采用基因芯片结合流式细胞术等技术研究日本血吸虫感染小鼠过程中观察到:如同曼氏血吸虫感染,IFN-γ的基因转录水平从感染急性期至慢性期逐步受到抑制;但是值得关注的是,干扰素刺激基因(ISGs)(如:IGTP,GBP,ICSBP等),受抑制程度尤为显著,表现为下调发生较IFN-γ早(成虫排卵前),且下调速度更快。ISGs是IFN-γ下游通路中的作用因子,其表达下调则反映出随着日本血吸虫感染进程,宿主体内存在着干扰素通路的抑制,阻碍干扰素生物学效应的发挥。 IFN-诱导的p47 GTP酶家族是近十年来在多种脊椎动物中发现的一类重要的具有抗感染作用的蛋白家族。目前已经克隆了小鼠p47GTP酶家族中的六个成员,分别是LRG-47、GTPI、IGTP、IRG-47、IIGP和TGTP/Mg21。研究发现,p47 GTP酶能够特异地参与抵抗胞内细菌和原虫的感染,对病毒的清除能力较弱。虽然同属于p47 GTP酶家族,但不同成员所表达的抗力具有病原体和时相特异性的特点。然而,p47 GTP酶在更为复杂的多细胞生物,例如重要的胞外蠕虫—血吸虫感染中的作用目前还未见报道。鉴于本实验室前期研究发现,p47GTP酶随日本血吸虫感染进程,信号强度呈下调趋势,且家族中各成员的表达强度存在明显差异,提示不同p47 GTP酶在多细胞生物感染中的作用可能不尽相同。在本研究中,我们探讨了IFN-诱导的p47 GTP酶家族中的IGTP和IRG-47在日本血吸虫急性感染中的作用特点及参与保护性免疫的能力,以进一步深化血吸虫的感染免疫学,为血吸虫病疫苗研制提供理论基础。本研究采用IGTP基因敲除(IGTP~(-/-))和IRG-47基因敲除(IRG-47~(-/-))小鼠,以相同遗传背景的野生型C57BL/6J小鼠(wild-type,WT)为对照,建立日本血吸虫急性感染的小鼠模型。为了观察感染/致病结果,在感染后6w通过肝门静脉冲虫计数成虫数、消化肝脏计数虫卵数,以HE染色和Masson三色染色观察肝脏的病理变化;为了观察感染后宿主的整体免疫应答反应,以间接ELISA法检测血清中日本血吸虫特异性IgG抗体,以Bio-plex技术检测感染急性期血清和脾脏淋巴细胞培养上清中Th1/Th2型细胞因子的表达水平;鉴于p47 GTP酶主要表达在巨噬细胞以及巨噬细胞在天然免疫中的重要作用,我们观察了基因敲除后对巨噬细胞功能的影响。通过贴壁法分离纯化脾脏巨噬细胞后,采用荧光实时定量PCR法检测巨噬细胞中p47 GTP酶家族三个成员(igtp、lrg47、irg47)的mRNA水平,以考察一种基因缺失后是否存在p47 GTP酶家族其他成员的交叉调控;以流式细胞术检测不同时期(感染前、虫卵沉积前期、感染急性期)巨噬细胞上表面分子MHC-Ⅱ类、CD16/32、CD40、CD80的表达水平,观察巨噬细胞的抗原递呈功能;在脂多糖(LPS)刺激下,采用硝酸还原酶法观察巨噬细胞培养上清中一氧化氮(NO)的浓度;通过体外杀伤童虫的试验,观察在血清抗体的协同下巨噬细胞的杀伤活性。本研究获得如下主要结果: 1、在日本血吸虫急性感染过程中,IGTP~(-/-)小鼠与WT小鼠相比表现出相似的感染结局,而IRG-47~(-/-)小鼠能部分限制急性感染。IGTP~(-/-)组的成虫数和虫卵数略高于WT组,而与这两组相比,感染后IRG-47~(-/-)组小鼠的成虫数和虫卵数明显减少。在HE染色的病理切片中,IGTP~(-/-)组和WT组可见大量虫卵聚集在汇管区,而IRG-47~(-/-)组集中在汇管区的虫卵则较少。在IRG-47~(-/-)组,含有单个虫卵的肉芽肿中可见大量的嗜酸性粒细胞聚集,包绕虫卵的细胞总数也较IGTP~(-/-)组和WT组显著增多。Masson染色显示,WT组虫卵肉芽肿周围的总胶原含量显著高于IGTP~(-/-)组和IRG-47~(-/-)组。 2、在日本血吸虫感染急性期,IRG-47~(-/-)小鼠的细胞免疫应答水平低于IGTP~(-/-)小鼠和WT小鼠,IGTP~(-/-)小鼠较WT小鼠有所增强。血清中细胞因子检测显示,IGTP~(-/-)小鼠和WT小鼠在感染急性期能够产生大量的Th1/Th2型细胞因子,且IGTP~(-/-)小鼠较WT小鼠产生较多的GM-CSF和IL-2。但是,IRG-47~(-/-)小鼠产生的细胞因子,无论是Th1型还是Th2型,都显著低于IGTP~(-/-)小鼠和WT小鼠。脾淋巴细胞以可溶性虫卵抗原(SEA)或ConA刺激后检测上清中的细胞因子显示,在特异性抗原和有丝分裂原刺激下,IGTP~(-/-)小鼠脾脏淋巴细胞产生的IL-12p70、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF、IL-5和IL-10的水平均较WT小鼠显著增高。IRG-47~(-/-)组与WT组相比,在ConA刺激下,IRG-47~(-/-)组脾淋巴细胞产生IL-12p70和IL-10水平高于WT组,余细胞因子在两组间无显著性差异。 3、就产生成虫特异性IgG抗体的能力而言,IGTP~(-/-)小鼠略强于IRG-47~(-/-)小鼠和WT小鼠。随着日本血吸虫感染的发展,三组小鼠血清中日本血吸虫特异性IgG抗体水平均持续升高。在日本血吸虫急性感染期,针对可溶性成虫抗原(SWAP)特异的IgG抗体水平,在IGTP~(-/-)组小鼠显著高于IRG-47~(-/-)组和WT组;针对可溶性虫卵抗原(SEA)特异的IgG抗体水平,在三组小鼠间均无显著性差异。 4、irg47基因缺失后可能存在igtp和lrg47基因的交叉调控。从感染后3w到6w,在WT小鼠的巨噬细胞中,igtp和lrg47基因的表达有下降趋势,而irg47基因变化较小。在IGTP~(-/-)小鼠的巨噬细胞中,lrg47和irg47基因表达下调。相反,在IRG-47~(-/-)小鼠的巨噬细胞中,igtp基因的表达变化较少,而lrg47基因的表达明显上调。这提示IRG-47缺失后可能存在igtp和lrg47基因的交叉调控,而IGTP缺失则不存在。 5、igtp或irg47基因缺失不影响巨噬细胞发育成熟。随着日本血吸虫感染的发展,巨噬细胞表面分子MHC-Ⅱ类(I-A)、CDl6/32、CD40和CD80,无论是在基因敲除小鼠还是野生型小鼠的表达均明显上升。在感染前和感染后3w,IGTP~(-/-)组CD16/32和CD40的表达均较IRG-47~(-/-)组和WT组高;在感染后6w,三组间各分子标记的表达均无显著性差异。巨噬细胞表面分子的表达类型提示,在日本血吸虫感染早期,igtp基因缺失时,可能增强巨噬细胞CD16/32(FcγⅢ/Ⅱ)介导的抗原递呈处理能力。 6、在日本血吸虫感染急性期,巨噬细胞产生炎症因子NO的潜能不受IGTP和IRG-47缺失的影响。在日本血吸虫感染前,不论有无LPS刺激,各组巨噬细胞产生的NO均无显著差异。在感染后6w,无任何刺激的情况下,IGTP~(-/-)组的巨噬细胞较IRG-47~(-/-)组和WT组的巨噬细胞产生更高水平的NO;而以LPS刺激后三组巨噬细胞产生NO水平无显著性差异。 7、感染活化的巨噬细胞与血清体外协同杀伤童虫试验显示,IGTP~(-/-)组的童虫死亡率显著高于WT组。预试验结果表明,感染活化的巨噬细胞协同日本血吸虫感染血清或青蒿琥酯化疗血清具有杀伤童虫活性。以日本血吸虫感染IGTP~(-/-)、IRG-47~(-/-)和WT小鼠6w的巨噬细胞和相应的血清体外协同杀伤童虫试验显示,IGTP~(-/-)组的童虫死亡率为37.5%,明显较WT组(29.41%)高。IGTP~(-/-)组的高童虫死亡率可能与其血清中针对日本血吸虫成虫特异性IgG抗体水平较高有关。综上,在日本血吸虫急性感染期,IGTP~(-/-)小鼠和IRG-47~(-/-)小鼠在感染/致病结局、整体免疫应答,以及巨噬细胞功能等方面均存在明显的差异,提示不同p47 GTP酶(IGTP,IRG-47)在宿主建立对日本血吸虫感染抗力过程中可能发挥着不同的作用。但为何不同p47 GTP酶的敲除会造成宿主在日本血吸虫感染后出现不同的感染结局,继之引起免疫应答的差异,还有待进一步研究。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

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