毕赤酵母表达的重组人干扰素λ1（IL-29）的表达、纯化及抗肿瘤活性的初步研究

发布时间：2018-03-24 22:36

  本文选题：IFN-λ1　切入点：毕赤酵母　出处：《中国协和医科大学》2008年硕士论文

【摘要】： IFN-λs是最新发现的一类具有抗病毒活性的干扰素样细胞因子,包括IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B)。IFN-λs在基因结构上与IL-10家族十分相似,而在氨基酸组成和功能方面与Ⅰ型IFN更为接近,在IL-10家族和Ⅰ型IFN之间建立了进化上的联系。因此IFN-λ1具有开发成抗病毒抗肿瘤药物的潜在价值。 本组前期工作中通过RT-PCR从人外周血淋巴细胞中克隆了IFN-λ1 cDNA,通过基因重组及酵母表达技术,已设计并表达了一种新的重组人干扰素λ1(IL-29)蛋白。前期工作表明,该重组蛋白能够在毕赤酵母中正确分泌性表达,具有能够诱导Hela细胞内的STAT1磷酸化的生物学活性。本论文在此基础上,对重组人干扰素λ1的表达纯化,理化性质鉴定,受体分布和抗肿瘤生物活性几个方面进行了进一步的探索。 本论文的第一部分工作是使用本组保存的含pAO815-4αF-IFNλ1表达质粒的甲醇营养型酵母菌种,通过BMG培养,在BMMY中进行诱导表达,其中低糖基化20kD rhIFN-λ1表达水平约为9.32mg/L,表达产物经SPFF阳离子交换层析及Superdex75分子筛层析纯化,和HPLC鉴定,获得较纯的重组人IFN-λ1(recombinant humanIFN-λ1,rhIFN-λ1)蛋白。对纯化程序作了产率,纯度分析,并对重组蛋白作了质谱,N端测序,等电点等理化性质的鉴定。 IFN-λs受体隶属于Ⅱ型细胞因子受体家族,由两个亚基构成,即IL-28R(或称CRF2-12)和IL-10R2(或称CRF2-4)。其中IL-28R是IFN-λs受体特有的亚基,CRF2-4最早是作为IL-10受体(IL-10R)的小亚基被发现的,故又称为IL-10R2,同时IL-10R2还是IL-22R和IL-26R的共有亚基。本论文的第二部分工作是通过RT-PCR及实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR)方法,对三个肿瘤细胞系进行了IFN-λR复合物表达特异性的鉴定。RT-PCR检测IL-28R在两株实体瘤细胞株:人宫颈癌细胞株Hela及人结肠癌细胞株HCT116中均有表达,但在骨髓造血系统来源的人淋巴瘤细胞株U937细胞中未检测到表达。实时荧光定量PCR对Hela、HCT116、U937细胞以各自的GAPDH为参照计算各自IL-28R基因的相对表达量。结果显示,Hela和HCT116细胞中IFN-λs特异的受体大亚基IL-28R的相对表达量远高于U937中的相对表达量。 分别以Hela、HCT116及U937细胞为实验对象。MTT比色实验发现,IFN-λ1在10、100和1000ng/ml三个不同浓度对Hela细胞增殖的抑制率分别为15.20±4.73%,16.57±9.80%和25.88±12.48%;对HCT116细胞增殖的抑制率分别为11.62±10.08%,1.83±2.46%和21.22±6.48%,高于其对U937细胞增殖的抑制率11.46±3.48%,13.46±3.83%和8.87±2.73。相反,对照组IFN-α2a 1000IU/ml对U937细胞增殖的抑制率20.39±1.24%,高于其对于Hela和HCT116细胞增殖的抑制率7.25±1.58%和6.52±1.87%。因此IFN-λ1因其IL-28R表达水平和组织分布的特异性显示了与IFN-α差异的抗肿瘤活性。 上述研究结果为促进IFN-λ1的纯化、性质、功能的研究打下了基础,对其由于受体分布特异的原因可能较少抑制骨髓造血系统来源的细胞增殖提供了初步的依据。为了将rhIFN-λ1真正应用于临床的肿瘤治疗中,还有更多关于制备工艺和动物实验的研究工作有待完成。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R341;R96

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本文编号：1660353