铜绿假单胞菌外膜蛋白OprM原核表达模型的构建及表达

发布时间：2018-03-25 01:40

  本文选题：铜绿假单胞菌　切入点：OprM蛋白　出处：《昆明医学院》2009年硕士论文

【摘要】： 目的构建铜绿假单胞菌主动外排系统外膜蛋白OprM的原核表达模型,并诱导OprM蛋白的表达。 方法采用基因工程技术,通过对实验条件的探讨,拟确定带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点及其保护碱基的铜绿假单胞菌oprM基因的PCR扩增条件,将oprM基因和载体pET28a-c(+)进行体外重组后导入受体菌BL21(DE3),通过抗性筛选、菌落PCR扩增、酶切验证和DNA测序等方法筛选正确的外膜蛋白OprM的原核表达模型。再对影响OprM蛋白表达的重要因素进行探讨,拟确定最适的诱导条件,诱导表达带有组氨酸标签的融合蛋白OprM,并用SDS-PAGE和Western Blot技术对表达蛋白进行验证。 结果 1.通过对实验条件的探讨,扩增带有EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点及其保护碱基的oprM基因序列的PCR反应体系为:dNTP 200μmol/L,MgSO_4 1.5mmol/L,引物400nmol/L,保真酶(Pfu)0.1U/μl,模板1μl,2×增强剂,1×反应缓冲液,总体系50μl。反应条件为:95℃预变性5 min,95℃45 sec、50℃1 min、72℃2 min,循环次数35,72℃延伸7min。扩增完成后,在反应体系中加入普通Taq DNA聚合酶0.6μl(3U),于72℃延伸20 min以修饰PCR产物A尾。 2.对质粒pET28a-c-oprM中的oprM基因片段进行正反两个方向的序列测定,所得序列应用Blast 2进行分析,与GeneBank中公布的oprM基因序列基本吻合,发现一个碱基突变,经验证为密码子同义突变,不影响蛋白质序列翻译。 3.通过对OprM蛋白表达条件的探讨,最适诱导条件为BL21-pET28a-c-oprM在含终浓度为0.05mg/ml卡那霉素(Kanamycin)的LB培养基中生长到浓度为0.5 OD_(600)时,加入1.5mmol/L终浓度的诱导剂IPTG,25℃振荡培养过夜。 4.SDS-PAGE和Western Blot检测结果显示,诱导表达的目的蛋白OprM确为带His·Tag的不可溶蛋白。 结论成功构建了铜绿假单胞菌主动外排系统外膜蛋白OprM的原核表达模型BL21-pET28a-c-oprM并诱导表达了带His·Tag的OprM蛋白。
[Abstract]:Objective to construct a prokaryotic expression model of outer membrane protein (OprM) of Pseudomonas aeruginosa active efflux system and induce the expression of OprM protein. Methods by using genetic engineering technique, the conditions of PCR amplification of oprM gene of Pseudomonas aeruginosa with EcoR 鈪，

本文编号：1661009