蜂毒短肽疏水性尾部增加阳离子聚合物的基因转染效率及其在siRNA转染中的应用

发布时间：2018-03-25 17:47

本文选题：蜂毒因子　切入点：阳离子聚合物　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2008年硕士论文

【摘要】： 近年来,阳离子聚合物载体是基因治疗的一个重要研究方向。与脂质体相比,阳离子聚合物具有毒性低,生物相容性好的优点。其中,聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)是目前研究最多的阳离子聚合物载体。PEI能结合质粒DNA并将其浓缩为纳米级复合物,在体外基因转染和动物体内基因治疗研究中均显示出良好的转染效率。然而在一些细胞系中其转染效率仍明显低于以Lipofectamine 2000为代表的阳离子脂质体转染试剂。阳离子脂质体的分子中有带正电荷的极性头和亲脂的尾,其亲脂的尾部能够促进转染试剂穿越细胞膜进入细胞并从内涵体释放;而阳离子聚合物则无亲脂结构,只能依靠“质子海绵”效应胀破内涵体,推测是它从内涵体中释放的能力较差的原因之一。为克服阳离子聚合物的不足,人们发现通过引入穿膜肽与之交联的方法可进一步提高转染效率。其中蜂毒因子Melittin是一种穿膜能力较强的穿膜肽,长26个氨基酸(GIGAVLKVLTTGLPA LISWIKRKRQQ),其N端1-20位为带负电的氨基酸形成疏水性的尾部,N端21-24位为带正电荷氨基酸形成的头部,与脂类化合物的结构非常相似。Ogris等将Melittin疏水性的尾部与PEI交联,能够在人宫颈癌HeLa细胞中有效增强PEI的基因转染效率。在以往研究中,我们发现Melittin疏水尾部能够增强PEI介导的基因转染效率。本研究拟进一步探讨使用蜂毒短肽疏水性尾部增加支链聚乙烯亚胺(BPEI)在HeLa细胞中的转染效率的机理。我们合成了Melittin的疏水性尾部20个肽(命名为MT20);使用血红蛋白释放实验检测其穿透细胞膜的能力;将MT20与支链聚乙烯亚胺(BPEI,25KD)按一定比例混合后,与EGFP-N1质粒DNA混合,通过DNA凝胶迟滞实验检测MT20对BPEI结合质粒DNA的能力;使用Brookhaven Zeta PALS动态光散射仪器检测形成MT20/BPEI/DNA三聚体的表面电势和颗粒大小;将三聚体加入HeLa等细胞中观察其基因转染效率;以MTT法检测基因转染后细胞存活率。结果显示低浓度的MT20不会引起红细胞溶血反应,随着MT20浓度的提高,红细胞在PBS(pH7.2)和PCS (pH5.6)缓冲液中的溶血率逐步升高,当MT20的浓度为20.0μmol/L时,在两种缓冲液中的溶血率分别为82%和59%,提示在中性和酸性条件下,该疏水片段均可穿透细胞膜导致红细胞溶血。加入MT20后,BPEI/DNA复合物的凝胶电泳行为未发生变化,说明加入MT20不会影响BPEI与DNA的结合能力。MT20/BPEI/DNA的的表面电势有所下降,复合物颗粒变化不大,而当MT20/BPEI比例为2:1时,粒径有所增大,但总体来说表面电荷和粒径大小均符合基因转染的要求。使用96孔板进行基因转染,当BPEI量为75 ng/孔时,加入MT20可以使GFP的表达水平得到不同程度的增高,当MT20的量为112.5 ng/孔时转染效率最高,其GFP的荧光强度达4821.3 RFU,大约为单独使用BPEI时的4倍,略高于Lipofectamine 2000转染后的4719 RFU。表明MT20能够显著增加BPEI在HeLa等细胞系的基因转染效率。在细胞存活实验中,单独使用BPEI进行转染时的细胞存活率为73.81%,加入MT20后可以降低BPEI的用量;在最适条件下,其细胞存活率达到94.44%,说明MT20不仅可以提高BPEI的转染效率,而且可以降低基因转染导致的细胞毒性。 HeLa细胞是生物学实验,特别是肿瘤生物学研究最常用的模式细胞之一,其应用范围非常广泛。由于BPEI在HeLa细胞的基因转染效率很低,大约为5-10%之间。因此本研究的另一个目的是在MT20的增强作用下,将针对ATR基因的siRNA表达载体较为高效地导入HeLa细胞,观察siRNA对肿瘤细胞ATR基因表达的抑制效果,并进一步分析ATR基因表达水平抑制之后,细胞对烷化剂药物的敏感性变化。结果显示MT20与阳离子聚合物BPEI混合体可以有效将siRNA表达载体导入HeLa细胞内,Western印迹实验显示未转染的HeLa细胞可正常表达ATR蛋白,而siRNA+细胞几乎没有ATR条带,提示siRNA明显抑制ATR基因表达水平。药物敏感性实验结果显示HeLa细胞和siRNA+HeLa细胞均对盐酸尼莫司汀(ACNU)有很强的抗性,单独使用ACNU,半数抑制剂量(ID50)均超过100?g/ml,而siRNA+ HeLa对ACNU的抗性较对照HeLa细胞更强。链脲菌素(STZ)处理能够提高肿瘤细胞对ACNU的敏感性,当预先以10 mmol/L的STZ抑制细胞MGMT活性,然后使用ACNU处理细胞时,细胞对ACNU的敏感性大幅提高, ID50均10?g/ml,siRNA+ HeLa对ACNU的更为敏感一些。研究结果表明针对ATR的shRNA能够影响HeLa细胞对烷化剂药物的敏感性,对研究烷化剂的作用机理具有一定的意义。总之,本研究表明MT20具有与Melittin全长相当的穿透细胞膜的活性,可以作为一种良好的增强剂,可在难以转染的细胞系中增加阳离子聚合物的基因转染效率,为进一步进行基因功能研究奠定基础。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R346

【参考文献】