金黄色葡萄球菌候选疫苗组分的筛选与评价

发布时间：2018-03-26 22:06

本文选题：金黄色葡萄球菌　切入点：疫苗　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2010年硕士论文

【摘要】： 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种重要的革兰氏阳性条件致病菌,为人畜共患病原菌,可引起多种严重感染。感染金黄色葡萄球菌,通常依赖抗生素治疗,但由于抗生素的滥用,出现多种耐受抗生素的新菌株,研究表明40%-60%的临床分离株对多种抗生素具有抗性,特别是耐甲氧西林菌株的迅速蔓延使得单纯依靠抗生素治疗金黄色葡萄球菌引发的相关疾病变得越来越不可靠,金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)疫苗是预防感染的有效手段,可缓解抗生素应用所致的选择性压力,大大延缓耐药菌的产生,且与抗生素协同作用,有望解决金葡菌感染这一棘手问题。金黄色葡萄球菌疫苗的研究具有重要的军事意义和民用价值。因烧伤、枪伤而使感染几率增高的士兵、消防人员、警务人员等,接种金黄色葡萄球菌疫苗可极大的减少因严重感染而引发的死亡。据不完全统计,全球因慢性肾功能衰竭而需要进行透析的病人已达200余万,北京、上海两大城市中,每年新增透析患者的人数均在4000例左右,这一人群透析过程中感染金葡菌的几率非常高。国内一项研究结果表明,烧伤面积大于30%者,40%并发金黄色葡萄球菌引起的脓毒症,其中20%的患者最终转为多器官功能障碍综合症,50%以上死亡。另据报道75%的早产儿脓毒症是由金黄色葡萄球菌引起的。对这些人群接种金黄色葡萄球菌疫苗将极大的改善其生存质量,降低并发症的发生率和死亡率。 Watson等曾用灭活的金黄色葡萄球菌制作疫苗,但由于该疫苗为全菌疫苗,除保护性抗原外,还有许多不相关和有毒的成分,毒副反应较大,临床应用受限。另外,金黄色葡萄球菌感染宿主后,尽管宿主相应抗体水平显著升高,但有抗体存在的宿主还是会被感染,显然,这些抗体不能起到有效的保护作用,因而要得到能激发保护性抗体的疫苗必须寻找其他抗原。金葡菌不像其它大多数致病菌那样有一个或几个主要的致病因子,这就使得金葡菌疫苗的研究困难重重。国内外专家学者在这方面做了许多卓有成效的工作,找到多种与金黄色葡萄球菌致病力相关的因子,如毒素、荚膜、胞外基质结合蛋白、表面蛋白、毒力因子表达调控蛋白等,并就这些分子作为新一代抗金黄色葡萄球菌疫苗的有效成分作了深入研究。要设计一种有效的金黄色葡萄球菌疫苗仍存在许多障碍,因为金葡菌毒力因子众多(如:粘连素,胞外酶,外毒素),金葡菌调控这些因子的路径复杂。动物实验数据显示:多组分的金葡菌疫苗对控制金葡菌感染可能具有较好的前景。本研究即根据国内外的相关文献报道选取20种与金黄色葡萄球菌毒性相关的蛋白,包括毒素:溶血素(孔形的溶血性的外蛋白)、自溶素、杀白细胞素、肠毒素,胶原结合蛋白,粘附因子,纤维结合素结合蛋白,葡萄球菌A蛋白,丝氨酸-天冬氨酸序列重复蛋白及其他与金葡菌毒性相关的表面蛋白。对它们是否能保护机体对抗金葡菌感染进行一系列研究,旨在筛选出具有显著保护效果的金黄色葡萄球菌蛋白,制备多组分疫苗预防、治疗各类金黄色葡萄球菌引发的感染。实验内容包括两个部分:一.金黄色葡萄球菌候选保护性抗原的表达、纯化。以金黄色葡萄球菌USA300、12598基因组DNA作为模板,根据GenBank中各种蛋白的基因序列设计引物,以PCR方法扩增目的基因,将其克隆入pET-21a(㧏),DNA测序鉴定结果表明,编码的氨基酸序列与预期一致。获得的重组质粒转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导后目的蛋白得以高效表达,经分析表达蛋白分子量与预期基本一致。我们根据各蛋白的等电点用SP Sepharose F.F柱或Q Sepharose F.F.柱进行第一步纯化,又根据目的蛋白羧基端带有His标签,用镍柱进一步纯化,最终得到纯度较高的蛋白,并对纯化蛋白进行定量。二.候选保护性抗原免疫保护性分析。分别以菌株USA300、12598、546、1885基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因。菌体USA300、546、1885分别免疫小鼠后,收集血清,通过点杂交筛选目的蛋白,结合上述PCR结果初步确定各基因在这几株菌中的分布情况。为了研究候选是否具有广谱抗金黄色葡萄球菌感染的效果,本研究通过免疫学方法检测候选的保护效果。首先测定菌株USA300的LD50,另一方面选取目的蛋白ClfA、FnbA、FnbB、SasF与铝佐剂混合免疫BALB/c小鼠,收集免疫血清,测定抗体滴度。第三次免疫一周后,用菌株USA300的一个LD50攻击免疫后的小鼠,观察小鼠存活情况。目前已得到20种目的蛋白的表达纯化产物,并对其进行定量。根据点杂交与PCR结果,我们选取ClfA、FnbA、FnbB、SasF这四种蛋白进行动物实验,检测其抗金黄色葡萄球菌感染的效果。攻毒后小鼠存活情况显示这四种蛋白均无明显免疫保护效果,恐难以作为金葡菌疫苗的有效组分。
[Abstract]:Staphylococcus aureus ( Staphylococcus aureus ) is an important Gram - positive condition pathogenic bacteria . It is a kind of pathogenic bacterium for human and livestock , which can cause multiple serious infections . It is an effective means to prevent infection .

A vaccine against Staphylococcus aureus has been prepared by Watson et al . , but because the vaccine is a full - bacterial vaccine , there are many unrelated and toxic components besides the protective antigen .

In this study , 20 kinds of protein related to S . aureus toxicity were selected according to relevant literatures at home and abroad , including toxin : Hemolysin ( pore - shaped exoprotein ) , autolysin , cytolysin , enterotoxins , collagen - binding protein , adhesion factor , fibronectin binding protein , staphylococcus A protein , serine - aspartic acid sequence repeat protein and other surface proteins related to the toxicity of Staphylococcus aureus .

coli BL21 ( DE3 ) . The recombinant plasmid was cloned into pET - 21a ( ? ) .

At present , the expression and purification products of 20 kinds of proteins have been obtained and quantified . According to the results of dot blot and PCR , we select the four proteins of ClA , FnbA , FnbB and SasF to test their anti - Staphylococcus aureus infection . The survival of mice after challenge shows that these four proteins have no obvious immune protective effect , and they may be difficult to be used as an effective component of Staphylococcus aureus vaccine .

【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

【参考文献】