肠出血性大肠杆菌O157：H7 z3672基因的敲除与毒力评价

发布时间：2018-03-29 06:03

本文选题：O157:H7　切入点：Z3672　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2010年硕士论文

【摘要】： 病原微生物的流行对人类健康构成了重大威胁,研究病原微生物与宿主相互作用的分子基础,对预防与治疗感染性疾病、改善人类健康具有重要意义,它也一直是医学界面临的重要课题之一。生物信息学作为一门新兴学科已广泛地渗透到生命科学的各个研究领域,发挥着巨大作用。随着越来越多的全基因组序列的测定完成,对基因组序列进行比较分析,探索序列结构与病原微生物致病能力间关系的比较基因组学也应运而生,为病原微生物学的研究注入了新的活力。在前期研究中,我们应用生物信息学技术预测发现了一个新的蛋白家族(FlxA-like proteins),分析表明该蛋白家族可能参与细菌与宿主相互作用,并且可能是具有III型分泌系统的致病菌的重要效应蛋白(毒力蛋白)。肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E. coli,EHEC)O157:H7是常见的肠道致病菌,感染该菌可引起腹泻、出血性结肠炎,溶血性尿毒综合征及血栓形成性血小板减少性紫癜等严重并发症,严重者可导致死亡,致死率达5%～10%。1982年,Riley等报道了由O157:H7引起的出血性结肠炎的暴发流行,这也是把O157:H7确认为严重致病菌的首次报道。随后在加拿大、日本、英国、澳大利亚等地发生了多起该菌的感染流行。1999年,在我国安徽、江苏两省曾暴发流行O157感染性腹泻,患者超过2万人,死亡177人,流行时间7个月,可能是迄今为止世界上流行规模最大的一次。我国已将EHEC列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一。由于O157:H7的感染呈现暴发流行趋势,感染后对人体有强烈的致病性与致死性,而且抗生素治疗可能会加剧病情,因此,它已经成为全球性的公共卫生问题。O157培养容易、传播途径多样,感染性很强,100 CFU(菌落形成单位)即可致病,且多数病症较为严重。它也被美国疾病控制中心(CDC)列为B类生物恐怖病原体严加防范。通过近三十多年的研究,我们对O157:H7的致病机制已经有了初步认识,但尚未完全阐明,了解感染的致病机理对预防和治疗由该菌引起的流行性疾病具有重要的理论指导意义。我们应用生物信息学技术预测发现的新蛋白家族(FlxA-like proteins)成员中存在Z3672蛋白,它是一个来源于O157:H7的假想蛋白,根据预测信息我们推测它很可能是具有Ⅲ型分泌系统的致病菌重要的效应蛋白(毒力蛋白)。因此,通过对O157:H7 Z3672蛋白的研究,有望发现一个新的Ⅲ型分泌系统效应分子,从而推进O157:H7致病的分子基础研究工作,为进一步了解FlxA-like蛋白家族在细菌与宿主相互作用过程中所发挥的功能奠定基础。本研究通过Red重组系统成功构建了O157:H7 z3672缺失突变株。首先经过PCR、酶切、连接等步骤,构建了两端同源序列分别约500bp的z3672基因长同源臂打靶片段,该片段连接在pET-24a载体上。然后通过pKOBEG质粒介导的Red重组,使电击转化入菌体内部的同源臂打靶片段与O157:H7基因组序列进行了同源重组,经过抗性筛选、PCR鉴定以及测序分析,成功获得了O157:H7 z3672缺失突变体。通过Real-Time PCR实验,针对z3672基因在野生株是否转录进行了检测,比较O157:H7野生株与O157:H7 z3672缺失突变株中z3672基因的转录差异,并且证明了在O157:H7野生株中z3672基因存在转录活性。在获得了O157:H7 z3672缺失突变株后,主要对z3672基因的功能进行了初步研究。一方面,利用双向电泳以及蛋白质谱鉴定的方法,对O157:H7野生株和O157:H7 z3672缺失突变株进行了蛋白质组学分析。研究表明,在O157:H7 z3672缺失突变株中,外膜蛋白A(OmpA)的表达量升高。通过Real-Time PCR实验从基因的转录水平对以上实验结果进行了验证。结果证明,Real-Time PCR与双向电泳结果一致,因此,在O157:H7中,z3672基因与ompA(外膜蛋白A)基因存在某种联系,敲除z3672基因可以提高外膜蛋白A的表达水平。另一方面,通过体外细胞实验,比较O157:H7野生株与O157:H7 z3672缺失突变株对真核细胞(HeLa)造成的A/E损伤是否存在差异。利用细胞骨架蛋白的免疫荧光实验,观察O157:H7野生株与O157:H7 z3672缺失突变株分别粘附HeLa细胞后,细胞骨架蛋白Actin,Keratin,Tubulin改变差异。实验表明,敲除z3672基因前后, O157:H7对细胞骨架蛋白Actin,Keratin,Tubulin改变差异并不明显。这也说明,Z3672蛋白不是O157:H7中影响真核细胞骨架改变的核心因子。在细胞骨架肌动蛋白荧光染色实验中发现:利用含10% FBS的DMEM培养的O157:H7感染HeLa细胞后可以形成明显的肌动蛋白聚集现象。于是对这一现象进行了初步探索。利用不同的培养基条件(LB,DMEM,DMEM含10% FBS,DMEM含终浓度为25m mol/L HEPES)培养O157:H7并对其生长状态,粘附HeLa细胞,HeLa细胞骨架肌动蛋白聚集状况以及蛋白表达情况进行了初步分析。结果表明,虽然在DMEM含10% FBS中生长最慢,但是O157:H7粘附性以及对肌动蛋白聚集的能力是最强的。由于O157:H7对真核细胞的A/E损伤主要表现在两个方面,一是其对真核细胞的粘附作用;二是其对真核细胞的细胞骨架肌动蛋白聚集能力。因此,以上的实验结果也说明了利用含10% FBS的DMEM培养基培养的O157:H7对真核细胞的A/E损伤能力增强,进而其致病能力也增强了。本研究构建了O157:H7 z3672缺失突变株,证明了z3672基因的缺失可以上调外膜蛋白A的表达,并且证明该基因不是影响真核细胞骨架改变的核心因子,这些为进一步研究Z3672蛋白及FlxA-like蛋白家族在细菌与宿主相互作用过程中所发挥的功能奠定了基础。同时还发现,利用DMEM(10% FBS)培养的O157:H7与宿主细胞体外作用,可以使O157:H7对宿主细胞A/E损伤的能力增强,但具体的作用机制仍需要进一步研究,这也为更全面地了解O157:H7的致病机制提供了新思路。
[Abstract]:The epidemic of pathogenic microorganism constitutes a major threat to human health , and studies the molecular basis of the interaction between pathogenic microorganism and host . It has important significance for preventing and treating infectious diseases and improving human health .

Enterohaemorrhagic E . coli ( EHEC ) 157 : H7 is a common pathogen of intestinal tract infection .

Therefore , it is hopeful to find a new type III secretion system effector molecule by studying the protein of 157 : H7 Z3672 . Therefore , it is hopeful to find a new type III secretion system effector molecule to advance the molecular base research work of 157 : H7 , which lays the foundation for further understanding the function of the FlG - like protein family in the interaction of bacteria and host .

In this study , we have successfully constructed a mutant strain 157 : H7 z3672 by Red recombination system . First of all , we constructed z3672 gene long homologous arm targeting fragment of 500 bp homologous sequences by PCR , enzyme digestion , ligation and so on .

On the one hand , the expression of outer membrane protein A ( OmpA ) was analyzed by means of two - way electrophoresis and protein spectrum identification . The results showed that the expression of outer membrane protein A ( OmpA ) was increased by using two - way electrophoresis and protein spectrum identification .

A preliminary study was conducted in the cytoskeletal muscle actin fluorescence staining experiment . The results showed that : 1 % FBS , 10 % FBS , DMEM containing 10 % FBS , DMEM containing 10 % FBS , DMEM containing 10 % FBS , DMEM containing 10 % FBS , DMEM containing 10 % FBS , DMEM containing 10 % FBS , DMEM containing 10 % FBS and DMEM containing 10 % FBS was the strongest .

It is proved that the deletion of z3672 gene can up - regulate the expression of outer membrane protein A and prove that the gene is not the core factor affecting the transformation of eukaryotic cells .

【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R378.21

【参考文献】