基于DNA免疫的乙型肝炎病毒表面抗原大中小蛋白的免疫原性研究

发布时间：2018-03-31 19:14

  本文选题：乙型肝炎病毒　切入点：表面抗原　出处：《南京医科大学》2010年博士论文

【摘要】： 目的观察乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)大蛋白(LHBs),中蛋白(MHBs)和小蛋白(SHBs)DNA疫苗的免疫原性,分析其免疫应答模式及机制,为研究开发免疫原性更优的乙型肝炎病毒(HBV)预防或治疗性疫苗提供理论依据。 方法我们设计了HBV adr亚型HBsAg共识基因(consensus S gene for HBV adr subtype,adr-S-Cons),并据此构建了乙肝病毒LHBs,MHBs和SHBs DNA疫苗,经酶切和基因测序鉴定其构建正确;肌肉注射、活体基因导入方式分别对Balb/c小鼠分别进行LHBs,MHBs和SHBs DNA疫苗免疫,第0、2和4周共免疫3次,于每次免疫前和末次免疫后每两周收集血清;ELISA和Western blot法检测LHBs,MHBs和SHBs DNA疫苗表达产物与三种DNA疫苗免疫血清之间的相互识别;酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测LHBs,MHBs和SHBs免疫小鼠的抗原特异性抗体分泌细胞(ASCs)检测;同法检测LHBs,MHBs和SHBs免疫小鼠的抗原特异性细胞因子(IFN-γ、IL-2)分泌细胞。 结果1. DNA质粒经双酶切,可见分子量约1200bp、850bp及700bp的插入基因片段,与LHBs、MHBs、SHBs预期大小相符,测序结果与设计序列进行比对,两者吻合率为100%。 2. Western blot法检测结果表明,三种DNA疫苗的小鼠免疫血清对LHBs、MHBs和SHBs抗原成分均有一定程度的识别。 3.第一次免疫后两周3个实验组(LHBs、MHBs和SHBs免疫组)小鼠血清以ELISA法均能分别检测到抗商品化HBsAg、LHBs、MHBs和SHBs的特异性抗体。在第三次免疫后两周,3个实验组抗商品化HBsAg、LHBs、MHBs和SHBs的抗体滴度达峰值。LHBs、MHBs和SHBs DNA疫苗免疫后小鼠抗血清与商品化HBsAg抗原的结合能力,以SHBs抗血清最强,MHBs次之,LHBs再次之;与LHBs抗原的结合能力,以MHBs免疫后血清最强;与MHBs抗原的结合能力,以MHBs抗血清最强,SHBs次之,LHBs再次之;与SHBs抗原的结合能力,以MHBs和SHBs免疫后血清为高。 4.抗原特异性ASCs检测结果显示,商品化HBsAg抗原特异性ASCs数量在LHBs、MHBs和SHBs免疫组三组间两两比较均有显著性差异,P0.05,以SHBs组每107细胞中ASC数量最多,MHBs次之;LHBs抗原特异性ASC检测,LHBs、MHBs和SHBs三组间两两比较均无统计学差异,P0.05;MHBs抗原特异性ASCs检测,LHBs、MHBs和SHBs三组间比较,LHBs与其他两组比较均有显著性差异,P0.01,MHBs组抗原特异性ASCs数量最多,MHBs和SHBs组间比较无统计学差异,P0.05;SHBs抗原特异性ASCs检测,LHBs、MHBs和SHBs三组间两两比较均无统计学差异,P0.05,但以MHBs组抗原特异性ASCs数量为多。 5. LHBs,MHBs和SHBs DNA疫苗免疫小鼠的抗原特异性IFN-γ、IL-2分泌细胞检测表明,这两种细胞因子的分泌细胞数量在LHBs、MHBs和SHBs三组中比较,均无统计学差异,P0.05。 结论1、本研究构建的乙肝病毒LHBs、MHBs和SHBs三种DNA疫苗均能在小鼠体内诱导产生相应的免疫应答。 2、LHBs、MHBs和SHBs DNA疫苗对Balb/c小鼠的免疫原性有所不同,差别主要在体液免疫方面,而T细胞免疫方面未见明显差异。 3、比较LHBs、MHBs或SHBs三种DNA疫苗的免疫原性,在本实验体系中,以含preS2区的MHBs DNA疫苗为最强,SHBs次之,LHBs最弱。 4、鉴于MHBs DNA疫苗的良好免疫原性和HBV pre-S区免疫应答对HBV感染防治的重要意义,应将MHBs抗原列为重要的乙肝疫苗候选抗原。
[Abstract]:Objective to investigate the hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) protein (LHBs), protein (MHBs) and protein (SHBs) DNA vaccine and analysis of its immune response pattern and mechanism for the development of hepatitis B virus on immunogenicity better (HBV) provides a theoretical basis for the prevention or treatment of the vaccine.
Methods we designed the HBV subtype ADR HBsAg gene (consensus S gene for on HBV adr subtype, adr-S-Cons), and constructs the hepatitis B virus LHBs, MHBs and SHBs DNA vaccine by enzyme digestion and gene sequencing to identify the correct construction; intramuscular injection of in vivo gene type of Balb/c mice were respectively LHBs. MHBs and SHBs DNA vaccine, 0,2 and 4 weeks were immunized 3 times, each time before immunization and every two weeks after the last immunization, serum was collected for detection of LHBs and Western; ELISA blot, MHBs and SHBs DNA vaccine expressing the mutual recognition between products and three kinds of DNA vaccine immune serum enzyme linkedimmunospot (; ELISPOT) assay to detect LHBs antigen specific antibody in mice immunized with SHBs and MHBs secreting cells (ASCs) detection; the same method for the detection of LHBs antigen specific cytokine MHBs and SHBs mice (IFN-, IL-2) of secretory cells.
Results 1. DNA plasmid was digested by double enzymes. The inserted gene fragment with molecular weight of 1200bp, 850bp and 700bp was consistent with the expected size of LHBs, MHBs and SHBs. The sequencing results were compared with design sequences, and the coincidence rate between them was 100%..
The results of 2. Western blot assay showed that the immune sera of the three DNA vaccines were identified to a certain extent for the LHBs, MHBs and SHBs antigen components.
Two weeks after the first immunization 3. 3 experimental groups (LHBs, MHBs and SHBs immune group) in serum of mice were detected by ELISA method against commercial HBsAg, respectively LHBs, MHBs and SHBs specific antibody. In two weeks after the third immunization, 3 experimental groups of anti commercial HBsAg, LHBs. Antibody titer of MHBs and SHBs reached the peak at.LHBs, MHBs and SHBs DNA vaccine immunized mice antiserum with commercial HBsAg antigen binding ability with SHBs antiserum, the strongest, followed by MHBs, LHBs again; and binding ability of LHBs antigen, MHBs in serum after immunization with the strongest; MHBs antigen binding ability to MHBs was strongest, followed by SHBs, LHBs again; and binding ability of SHBs antigen, MHBs and SHBs in serum after immunization is high.
4. antigen specific ASCs detection results showed that the commercial HBsAg antigen specific ASCs in the number of LHBs, MHBs and SHBs groups were significantly difference of 22 P0.05 between the three groups, with group SHBs per 107 cells ASC up, MHBs times; LHBs antigen specific ASC detection, LHBs, MHBs and SHBs three comparison between the 22 groups were not statistically significant, P0.05; MHBs antigen specific ASCs detection, LHBs, MHBs and SHBs of the three groups, LHBs compared with the other two groups have significant difference, P0.01, MHBs group the number of antigen specific ASCs, MHBs and SHBs group showed no significant difference between the ratio, P0.05; SHBs antigen specific ASCs detection, LHBs, MHBs and SHBs three between the 22 groups were no statistically significant difference, P0.05, but the number of MHBs antigen specific ASCs.
5. LHBs, MHBs and SHBs DNA vaccine immunized mice antigen specific IFN- gamma, IL-2 secretory cells showed that the number of these two cytokines secretion cells in LHBs, MHBs and SHBs three groups were not statistically different, P0.05..
Conclusion 1, the three DNA vaccines of hepatitis B virus LHBs, MHBs and SHBs constructed in this study can induce corresponding immune responses in mice.
2, the immunogenicity of LHBs, MHBs and SHBs DNA vaccines to Balb/c mice was different, and the difference was mainly in humoral immunity, but there was no significant difference in T cell immunity.
3, compare the immunogenicity of three DNA vaccines of LHBs, MHBs or SHBs. In this experimental system, the MHBs DNA vaccine containing preS2 region is the strongest, SHBs times and LHBs is the weakest.
4, in view of the good immunogenicity of MHBs DNA vaccine and the importance of HBV pre-S area immune response to the prevention and control of HBV infection, MHBs antigen should be listed as an important hepatitis B vaccine candidate antigen.

【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

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本文编号：1692074