日本血吸虫Mago nashi样蛋白编码基因的功能鉴定

发布时间：2018-04-02 17:39

本文选题：日本血吸虫　切入点：激光共聚焦显微镜　出处：《安徽医科大学》2009年硕士论文

【摘要】： 血吸虫病是严重危害人民身体健康,阻碍社会经济发展的重大传染病。日本血吸虫致病主要是由于虫卵在肝脏大量沉积形成的虫卵肉芽肿及其纤维化。控制血吸虫性别分化、性成熟及雌虫产卵成为防治血吸虫病的重要策略之一。 Mago nashi基因(Genebank登录号BM735619)所编码的蛋白通过氨基酸序列分析发现在人,果蝇,线虫等绝大多数生物中至少有80%的同源性。已有报道该基因在正常情况下抑制雄性化基因的表达,是决定生殖细胞雄性化作用的基因。由此推测日本血吸虫Mago nashi基因在血吸虫的生殖系统中也起着较为重要的作用。为了解日本血吸虫Mago nashi蛋白的功能,我们首先通过激光共聚焦显微镜观察日本血吸虫在终宿主体内不同发育阶段的形态特征,然后用RNAi技术下调Mago nashi基因的转录水平,再观察干扰作用后虫体的发育(尤其是生殖系统发育)是否与正常虫体之间存在差异。日本血吸虫于终宿主体内的发育是一个复杂的过程,由适应自然外界生存过渡到适应终宿主体内生存,其生理、形态等方面发生了巨大变化。而这些变化对于我们研究日本血吸虫病的预防以及治疗具有重大的意义。激光共聚焦显微镜(CLSM)技术现已广泛的应用到生物医药和生命科学领域研究中去。曼氏血吸虫的激光共聚焦显微镜形态学研究已有报道,但日本血吸虫的激光共聚焦显微镜形态研究至今未见文献。本文我们设计单性以及双性感染日本血吸虫的方式感染小鼠,在双性感染中我们分别收集感染后15天,20天,25天,30天,35天的虫体;单性感染中我们收集感染后35天的虫体,将这些虫体通过固定,染色,脱色,脱水等一系列的处理后,最后于激光共聚焦显微镜下观察双性感染上述各发育阶段的形态发育特点,观察单性感染35天的形态特点。用激光共聚焦显微镜测量单性及双性感染35天虫体,包括:体长、体宽、睾丸长、睾丸宽、睾丸面积、卵巢长、卵巢宽、卵巢面积。激光共聚焦显微镜的观察以及统计学的分析结果发现双性感染中30天成虫各器官发育成熟,雄性成虫睾丸、抱雌沟、贮精囊、雄性生殖孔,雌性成虫卵巢、卵黄腺、卵黄管、卵模、梅氏腺、子宫等结构在激光共聚焦显微镜下结构清晰;各发育阶段虫体形态变化最为显著的是15-25天的虫体。感染后15天,33%雄性虫体已出现明显抱雌沟,8%虫体位于前端的睾丸可见含有少量排列稀疏生殖细胞,13%雌虫出现早期卵巢结构,卵细胞尚未分化;感染后20天,86%雄虫有5-7个含有较15天多的生殖细胞的睾丸,此时期生殖细胞之间界线仍不清楚。雌虫后半部可见卵黄腺,卵黄细胞数量较少且不成熟,排列稀疏。卵巢中可见较前数量多的未成熟卵细胞,但未见细胞分化;感染后25天,所有虫体生殖系统均已发育,卵黄腺中卵黄细胞明显增多,形态不规则,排列较为紧密。卵巢内卵细胞已出现细胞分化。90%以上雌虫子宫内可见少量虫卵。感染30天以及以上虫体均已发育成熟。单性感染35天虫体与双性相比,单性感染虫体体积均明显小于双性感染虫体,且发育均不成熟(雌虫尤为显著)。经SPSS 13.0统计软件分析单性感染35天虫体体长、睾丸长、睾丸面积、卵巢长、卵巢宽、卵巢面积均与双性感染35天虫体有显著性差异。按照双链RNA(dsRNA)体外合成试剂盒要求,我们从日本血吸虫童虫cDNA文库中扩增出Mago nashi基因,将其片段正、反义链连接上T7启动子,然后把连接有T7启动子的目的基因的正、反义链进行PCR扩增。将PCR产物转录成单链RNA(ssRNA)并将其纯化,最后把一对ssRNA混合合成dsRNA。阴性对照组我们采用试剂盒中提供的基因。在BTX电穿孔仪上,设定参数为125V电压、20ms脉冲时值、1次脉冲次数,将dsRNA电穿孔转染入机械制备的日本血吸虫童虫体内,体外培养于电转后第1,3,5天收集童虫,按TRIzol方法同时提取童虫的总RNA及总蛋白。经实时荧光定量PCR及Western blotting分别检测Mago nashi基因表达水平变化。结果发现Mago nashi基因的转录水平实验组分别于电穿孔后第1, 3, 5天较阴性对照组下降22%,69%,80%。该基因的蛋白水平在第1, 3, 5天较阴性对照组下降12%,39%,56%。实验结果证明dsRNA可以特异性的抑制日本血吸虫靶基因以及蛋白的表达且效果明显。经dsRNA电转的童虫注射入小鼠体内,6周后取出虫体通过一系列处理制成标本,在激光共聚焦显微镜下观察虫体内部各器官形态特征及测量虫体体长、体宽、睾丸长、睾丸宽、睾丸面积、卵巢长、卵巢宽、卵巢面积。结果发现SjMago dsRNA组中8条中6条雄虫睾丸内有大量精子出现,而雌虫中卵巢,卵黄腺中却没有明显特征变化;测得各项指标经SPSS 13.0统计软件分析阴性对照组与SjMago dsRNA组的体宽、睾丸长、睾丸宽、睾丸面积、卵巢长、卵巢宽、卵巢面积均有显著性差异。由此结果我们得出Mago nashi基因在日本血吸虫中是生殖相关基因,在生殖系统器官的正常发育起一定作用。
[Abstract]:Schistosoma japonicum is a major infectious disease which seriously endangers people ' s health and prevents socio - economic development . Schistosoma japonicum is one of the most important strategies to control schistosomiasis .

Mago nashi gene ( Genebank accession number BM735619 ) encoded by Genebank accession number BM735619 showed at least 80 % homology in most organisms such as human , fruit fly and nematode .

Laser confocal microscopy ( CLSM ) has been widely used in the field of biomedical and life sciences . The number of egg yolk cells was less and immature , and the cells were sparse . There were more immature oocytes in the ovary , but no cell differentiation was observed .

The expression level of Mago nashi gene was detected by means of real - time fluorescence quantitative PCR and Western blotting . The results showed that the expression level of Mago nashi gene was decreased by 12 % , 39 % and 56 % after electroporation . plays a certain role in the normal development of reproductive system organs .

【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R383.2

【参考文献】