肺炎链球菌体内诱导基因spd1672影响细菌荚膜形成的机制研究

发布时间：2018-04-03 05:23

  本文选题：肺炎链球菌　切入点：D39Δspd1672　出处：《重庆医科大学》2010年硕士论文

【摘要】： 【背景】荚膜多糖是肺炎链球菌的主要毒力因子,它具有抗吞噬作用,可使其免受宿主免疫攻击。荚膜丢失的肺炎链球菌很容易被吞噬细胞清除,毒力下降。本课题组前期工作从肺炎链球菌中筛选到一些体内诱导基因,其中的基因spd1672经过生物信息学分析,其表达产物含有脂质A核心-O抗原连接酶结构域,提示该基因可能与细菌荚膜形成相关。本课题拟对该基因与荚膜形成相关的功能进行初步鉴定。 【方法】采用长臂同源多聚酶链式反应(Long flanking homology polymerase chain reaction, LFH-PCR)构建spd1672缺陷菌;用小鼠毒力体内实验比较spd1672缺陷菌与野生菌的毒力;通过菌体连接实验,将无荚膜的R6菌(含有SPD1672蛋白)和spd1672等位基因缺陷的R6菌株分别与D39Δspd1672缺陷菌的荚膜多糖(CPS)共同孵育,ELISA检测菌体表面的CPS量,分析SPD1672蛋白的连接酶功能;利用透射电镜技术、ELISA和Immunblotting技术分析spd1672缺陷后细菌表面荚膜多糖的改变;并通过FQ-PCR技术检测cps基因簇cps2A、cps2D、cps2E、cps2H、cps2K、和RfbC的mRNA表达量,分析spd1672基因对荚膜多糖合成基因的调控作用。 【结果】成功构建D39Δspd1672缺陷菌株;小鼠体内毒力实验显示注射D39Δspd1672缺陷菌的小鼠全部存活,毒力较野生菌株显著减低(*P0.05),且注射到小鼠腹腔的缺陷菌全部被清除,腹腔液涂片未见细菌。透射电镜观察发现D39Δspd1672基因缺陷菌株荚膜结构不复存在。菌体连接实验结果显示,无荚膜的R6菌(含有SPD1672蛋白)与D39Δspd1672缺陷菌CPS共同孵育2小时后,R6菌体表面的CPS量增加,接近于野生菌的水平,spd1672等位基因缺陷R6菌株的CPS量未见增加;Immunoblotting分析结果显示,D39Δspd1672缺陷菌的细胞壁检测不到CPS,原生质的CPS量较野生菌显著减少,且缺乏大分子量的荚膜多糖成分;由于D39Δspd1672缺陷菌不能利用环境中的荚膜多糖,ELISA分析D39Δspd1672缺陷菌体中CPS量较野生菌显著减少,但培养基上清的CPS量较野生菌多。荧光定量PCR测定结果显示,除了cps2A无变化,D39Δspd1672缺陷菌株的cps2D、cps2E、cps2H、cps2K、RfbC基因表达都较野生菌的显著下降(*P0.05)。 【结论】上述实验结果提示:spd1672基因表达产物能将荚膜多糖连接到细菌表面,是一种新的肺炎链球菌荚膜多糖连接酶,是否有聚合酶功能,尚需更多的实验证据; spd1672基因还影响了多个荚膜多糖合成基因的表达,在荚膜形成调控机制中起关键作用;小鼠体内毒力实验提示spd1672基因是肺炎链球菌中的一个新的毒力因子。
[Abstract]:Background: capsule polysaccharide is the main virulence factor of Streptococcus pneumoniae.Streptococcus pneumoniae, which is lost in capsule, is easily cleared by phagocytes and its virulence decreases.Some induced genes were screened from Streptococcus pneumoniae in the early stage of our work. The gene spd1672 was analyzed by bioinformatics, and the expressed product contained the ligase domain of lipid A core antigen.These results suggest that this gene may be related to the formation of bacterial capsule.The purpose of this study is to identify the function of the gene associated with capsule formation.[methods] the long arm flanking homology polymerase chain reaction (LFH-PCR) was used to construct spd1672 deficient bacteria, the virulence of spd1672 deficiency bacteria and wild bacteria were compared with mice virulence in vivo.R6 strain without capsule (containing SPD1672 protein) and R6 strain with spd1672 allele deficiency were incubated with D39 螖 spd1672 deficient strain, respectively, to detect the CPS quantity on the cell surface and analyze the ligase function of SPD1672 protein.鍒╃敤閫忓皠鐢甸暅鎶，

本文编号：1703822