重组免疫毒素ScFv-PE40在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定

发布时间：2018-04-05 04:06

本文选题：重组免疫毒素　切入点：ScFv-PE40　出处：《吉林农业大学》2008年硕士论文

【摘要】： 猪囊尾蚴病是危害最为严重的人畜共患寄生虫病之一,该病不仅造成巨大的经济损失,而且对人类存在着重要的健康隐患。人不仅是中间宿主,而且是唯一的终末宿主。囊尾蚴常在脑、眼、心脏等重要器官寄生,其中以寄生于神经系统的脑囊虫病引起的临床症状最为严重,极大危害了人类健康。多年来防治本病主要是以药物防治为主,但是由于抗药性的不断出现以及药物残留等问题的严重性,使得利用免疫预防技术来取代药物成为控制猪囊尾蚴病的必然,且在寄生虫学界已达成了共识。课题组已经获得抗猪囊尾蚴头节抗原的单克隆抗体,并从抗体中已提取单链抗体ScFv,且与绿脓杆菌外毒素PE40链接并克隆到质粒载体pET28a中。本试验目的:通过重组免疫毒素基因ScFv-PE40在大肠杆菌BL21中表达及纯化,以获得具有一定纯度的重组免疫毒素,从而进行体外六钩蚴杀伤实验,验证重组免疫毒素的杀伤效果,为进一步动物实验和重组毒素的应用奠定基础,也为囊尾蚴病的预防和治疗提供理论依据。方法:首先通过CaCl_2法制作感受态大肠杆菌BL21,将含有抗囊尾蚴头节的单链抗体基因(ScFv)和绿脓杆菌外毒素基因(PE40)的重组质粒载体pET-28a转化到大肠杆菌BL21中,培养后,将菌液铺于含有卡那霉素的LB固体培养基上37℃过夜,次日观察菌落,并挑取12个菌落分别培养后,提取质粒,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,进而进行特异性的IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE和Western-Blotting分析鉴定,以检测蛋白的反应原性。将目的蛋白通过金属Ni~(2+)亲和层析柱纯化,纯化后,通过体外六钩蚴杀伤实验检测目的蛋白的杀伤作用,同时绘制杀伤曲线,为进一步的活体动物实验奠定基础,同时也为囊尾蚴疾病的预防和治疗提供理论依据。结果:将含有pET28-ScFv-PE40的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中后,提取质粒,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,经琼脂糖凝胶电泳,在约5400bp处和约1800bp处各有一条核酸条带,核酸长度与事先序列测定长度相同,说明菌中所含质粒为目的质粒。将E.coli BL21(DE3)通过IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,ScFv-PE40基因获得了表达,各小时的表达量几乎无差别,表达蛋白的相对分子量约为68kDa(3.5 kDa的pET-28a肽段和68 kDaScFv-PE40),表达量约占菌体总蛋白的13.8%。而含空质粒pET-28a的对照组则未见大小一致的蛋白质表达。为了进一步鉴定表达产物,将表达的蛋白质电转移至PVDF转移膜上,进行蛋白质印迹分析,可见68 kDa处有一条明显的蛋白印迹带,说明目的蛋白具有一定的反应原性。通过金属Ni~(2+)亲和层析柱纯化目的蛋白后,在约68×10~3处有一条蛋白富集带,位置与融合蛋白pET28-ScFv-PE40的表达蛋白相一致。SDS-PAGE分析表明,纯化后目的蛋白的纯度在95%以上,可溶性蛋白的回收率约为50%,回收量为5mg/L。将纯化的目的蛋白进行体外六钩蚴杀伤实验,并绘制杀伤曲线。由细胞杀伤曲线可得,随着时间的推移,处理组和对照组形态完整六钩蚴的数目均呈逐渐减少趋势,但加入重组毒素组形态完整六钩蚴数目的下降明显快于对照组(P＜0.05),并且比较三个杀伤曲线,可见随着重组免疫毒素剂量的减少,处理组下降逐渐减慢,表明重组毒素对六钩蚴具有较强的杀灭作用,但是重组毒素对六钩蚴的作用有一定的剂量依赖性。
[Abstract]:In this study , we have obtained the monoclonal antibodies against the disease of human beings , such as brain , eye , heart and so on , and have already reached a consensus in the field of parasite .

Methods : The recombinant plasmid pET - 28a ( pET - 28a ) was transformed into E . coli BL21 ( BL21 ) by CaCl2 method . After incubation , the recombinant plasmid pET - 28a was cultured on LB solid medium containing kanamycin . After the culture , the recombinant plasmid was purified and purified by SDS - PAGE and Western - Blotting analysis . The target protein was purified by SDS - PAGE and Western - Blotting . The target protein was purified by SDS - PAGE and Western Blotting .

The results showed that the recombinant plasmid pET - 28a was transformed into E . coli BL21 , the plasmid was extracted , digested with EcoRI and HindIII . The expression of the recombinant toxin was about 68 kDa ( pET - 28a peptide fragment and 68 kDascFv - PE40 ) .

【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R346;S855.99

【参考文献】