表达幽门螺杆菌黏附素Hp0410的嗜酸乳杆菌菌株的构建及其免疫保护作用的初步研究

发布时间：2018-04-10 13:14

  本文选题：幽门螺杆菌 + 嗜酸乳杆菌　； 参考：《南方医科大学》2010年硕士论文

【摘要】：一、研究背景和目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是引起慢性胃炎和消化性溃疡的病原菌,并与胃腺癌和胃黏膜相关B细胞淋巴瘤的发生密切相关。Hp在世界人口中的感染率约为50%,在我国Hp感染率高达64%,其中发病率为约10%～20%,Hp感染大多发生于10岁以下儿童。Hp急性感染后,不易根除,在个人生活习性和社会环境影响下,极易发展为慢性胃炎和消化性溃疡。因此,怎样有效防治Hp感染,一直是国内外学者关注的一大难题。 目前,国内外常用三联药物(如胶体铋剂或质子泵抑制剂+克拉霉素+甲硝唑或阿莫西林)或四联药物作为临床一线疗法治疗Hp感染。但是,约20%患者不能得到有效根除,主要原因是Hp容易产生耐药性和患者对药物的顺应性差。如果Hp未能根除,多达75%～80%的患者很快又旧病复发。亦有学者认为,患者口腔中存在Hp,可源源不断地向胃内供应病菌,是导致Hp感染复发的另一重要原因。鉴于抗生素疗法不甚理想,且根除疗法只是感染后疗法,不能预防Hp感染,因此疫苗被认为是预防Hp感染最有效的方法,尤其是学龄前儿童进行预防性接种,对于预防Hp感染的长期效应和减少在人群中的传播十分重要。 幽门螺杆菌疫苗研究主要集中在蛋白质疫苗、DNA疫苗、全菌灭活疫苗和减毒活载体疫苗等。由于Hp主要经黏膜途径入侵,而蛋白质疫苗和DNA疫苗不能诱发有效的黏膜免疫,故免疫保护效果不甚理想。全菌灭活疫苗和减毒伤寒沙门菌活载体疫苗虽可诱发有效的黏膜免疫,但存在毒性大等不良反应。因此,迄今为止,尚无理想的疫苗应用于临床。 近年来,乳酸菌(Lactic acid bacteria)作为载体表达和传递目的抗原的研究备受关注。该菌安全、无毒,被公认为安全级微生物(GRAS, generaly recognize as safe)。乳酸菌可黏附定植于呼吸道、消化道、泌尿道等黏膜上皮细胞上,并可合成和分泌外源蛋白,诱发强烈的黏膜免疫应答,因此,乳酸菌表达系统具有传统疫苗载体难以比拟的优点。迄今,已在乳酸菌中表达了多种外源蛋白。例如,表达人乳头瘤病毒16型L1抗原的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)可有效诱导黏膜免疫,产生SIgA类抗体,使阴道黏膜免受人乳头瘤16型病毒感染；表达破伤风痉挛毒素C片段的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis),大大激发机体黏膜免疫和细胞免疫；表达肺炎链球菌Psp的乳酸菌(Lactic acid bacteria)经鼻内接种后,可激发强烈的黏膜IgA反应和细胞免疫,使机体获得抵抗致死性肺炎链球菌攻击的能力；表达登革病毒衣壳蛋白(EDⅢ)的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)经口服或鼻饲免疫小鼠后,可诱导黏膜免疫,保护小鼠免受感染。 本项研究选用嗜酸乳杆菌作为口服活疫苗的抗原投递载体。该菌能够与胃肠道黏膜上皮细胞紧密黏附,并可合成和分泌外源蛋白,与黏膜免疫系统直接接触,诱发有效的黏膜免疫应答,而无需大量培养细菌或纯化目的抗原,并且以口服方式作为免疫接种途径,对于某些人群尤其是儿童更为简便。相比乳酸乳球菌,嗜酸乳杆菌耐酸,不被胆汁所破坏,可在胃肠道内定植。 本项研究选用幽门螺杆菌黏附素Hp0410作为候选抗原。黏附素在Hp黏附定植过程中起决定性作用,且定位于菌体表面,具有良好的抗原性。特异的抗黏附素SIgA类抗体能有效地抑制Hp,阻止Hp在胃与十二指肠黏膜上黏附与定植。Hp0410属于Hp黏附素hpaA家族的基因同系物,是N-乙酰神经氨酰乳糖结合原纤维血凝素(N-acetylneuraminyl-lactose-bindinghaemagglutinin, NLBH)的亚基,有信号肽序列,且高度保守、抗原性高,以及与其他物种蛋白的同源性低等,适于作为重要的候选抗原之一。 本项研究拟构建高效、稳定、组成型表达Hp黏附素Hp0410的嗜酸乳杆菌,免疫SPF级C57BL／6小鼠后,考察诱发小鼠产生特异性免疫尤其是黏膜免疫的效果；用高致病性Hp标准菌株SS1攻击经重组嗜酸乳杆菌免疫后小鼠,探讨重组嗜酸乳杆菌拮抗Hp感染的免疫保护效果,为研制预防Hp感染的安全、有效的嗜酸乳杆菌活载体疫苗提供科学依据,具有重要的理论意义和应用价值。 二、研究方法 1、按照GeneBank中幽门螺杆菌标准株NCTC22696的DNA序列设计引物,通过PCR,从幽门螺杆菌标准株NCTC11639染色体DNA中扩增hp0410基因,克隆入T载体pMD19-S-T中,测序。从pMD19-S-T中切下hp0410,克隆入表达载体质粒pMG36e中,构建和鉴定重组质粒pGM36e-hp0410。 2、将重组质粒pGM36e-hp0410电转化至嗜酸乳杆菌中,挑取阳性转化子,提取质粒,行PCR、双酶切和DNA测序鉴定。体外大量表达后,经SDS-PAGE电泳、硝酸银染色和Western blot鉴定目的蛋白,并检测重组质粒的稳定性。 3、将重组嗜酸乳杆菌免疫SPF级C57BL／6小鼠后,于不同时间后处死,检测小鼠胃黏膜SIgA类抗体和血清中特异性IgG类抗体的效价,考察重组嗜酸乳杆菌诱发免疫应答的效果。同时,检测重组嗜酸乳杆菌在小鼠体内的存留时间。 4、选取SPF级雌性C57BL／6小鼠,灌饲NaHC03以损伤胃黏膜(利于Hp黏附定植),再以灌胃方式用高致病性Hp标准菌株SS1攻击,建立幽门螺杆菌感染小鼠模型。4w、8w和12w后处死后,取出小鼠胃组织进行石蜡包埋,切片后行HE染色,检测幽门螺杆菌感染及炎症情况。 5、选取SPF级C57BL／6小鼠,先用重组嗜酸乳杆菌免疫不同时间后,再用高致病性幽门螺杆菌SS1株攻击后处死,取胃组织,采用尿素酶试验、触酶试验、细菌分离培养和病理组织学检查,考察重组嗜酸乳杆菌拮抗幽门螺杆菌感染的免疫保护效果。 三、研究结果 1、从幽门螺杆菌NCTC11639菌株基因组DNA中扩增出Hp黏附素基因hp0410,大小约为750bp,测序结果与幽门螺杆菌标准株22695和J99对应序列相比对,同源性分别为95%和94%。构建重组质粒pMG36e-hp0410,并经电穿孔法转化入嗜酸乳杆菌中,成功构建重组嗜酸乳杆菌菌株。 2、重组嗜酸乳杆菌大量培养后,无需诱导,在上清中有目的蛋白的表达,分子量约为34kD。经Western blot检测,目的蛋白可与幽门螺杆菌感染阳性患者血清发生免疫学反应。重组质粒在红霉素选择压力下稳定性为97%,在没有红霉素选择压力下稳定性为90%。 3、重组嗜酸乳杆菌免疫C57BL／6小鼠后,经ELISA检测发现,可激发小鼠胃黏膜产生SIgA类抗体。重组嗜酸乳杆菌在小鼠体内的存留时间为34d。 4、以重组嗜酸乳杆菌免疫SPF级雌性C57BL／6小鼠,3w后,小鼠经NaHC03预处理后,再以高致病性幽门螺杆菌标准菌株SS1攻击,4w后,从胃组织中可分离培养出幽门螺杆菌,但菌量明显低于对照组,免疫后小鼠胃黏膜组织尿素酶试验和触酶试验均为阴性；幽门螺杆菌SS1株攻击未经免疫的小鼠后,其胃黏膜组织的尿素酶试验和触酶试验均为强阳性；病理切片显示经重组嗜酸乳杆菌免疫后的小鼠胃组织炎症病变明显轻于未经免疫小鼠。 四、结论 1、成功构建了组成型稳定表达幽门螺杆菌黏附素Hp0410的嗜酸乳杆菌重组菌株。 2、重组嗜酸乳杆菌免疫小鼠后,可诱生黏膜SIgA类抗体,有效拮抗幽门螺杆菌的感染。
[Abstract]:I . Background and purpose of research

Helicobacter pylori ( Hp ) is a pathogenic bacterium causing chronic gastritis and peptic ulcer , and is closely related to gastric adenocarcinoma and gastric mucosa - associated B - cell lymphoma . Hp infection rate is about 50 % in the world population . In China , Hp infection rate is about 50 % . In China , the infection rate is about 10 % ~ 20 % . Hp infection mostly occurs in children under 10 years old . Hp infection is very easy to develop into chronic gastritis and peptic ulcer .

Hp infection can not be prevented by Hp infection in the oral cavity of the patient , and the eradication therapy is only a post - infection therapy , which is another important reason for the recurrence of Hp infection .

Helicobacter pylori vaccine research mainly focuses on protein vaccines , DNA vaccines , whole - bacteria inactivated vaccines and attenuated live vector vaccines . Since Hp is mainly invaded by mucosal route , and protein vaccines and DNA vaccines cannot induce effective mucosal immunity , the immune protective effect is not ideal .

In recent years , lactic acid bacteria ( lactic acid bacteria ) have attracted much attention as a carrier expression and transfer target antigen . The bacterium is safe and non - toxic , and is widely recognized as safe class microorganism ( GRAS , generaly , as safe ) . The lactic acid bacteria can be adhered to mucous membrane epithelial cells such as respiratory tract , digestive tract , urinary tract and the like , and can synthesize and secrete exogenous protein , induce strong mucosal immune response , and thus , the lactic acid bacteria expression system has the advantages of difficult comparison with the traditional vaccine carrier .
Lactococcus lactis expressing tetanus toxin C fragment greatly stimulates mucosal immunity and cellular immunity ;
After intranasal inoculation , the lactic acid bacteria expressing Streptococcus pneumoniae Psp can stimulate strong mucosal IgA response and cellular immunity , so that the organism has the ability to resist the attack of S . pneumoniae ;
Lactococcus lactis expressing dengue virus capsid protein ( ED 鈪，

本文编号：1731346