CHO工程宿主细胞的重构

发布时间：2018-04-11 06:36

本文选题：细胞凋亡 + CHO　；参考：《中国人民解放军军事医学科学院》2008年硕士论文

【摘要】： 哺乳动物细胞是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主。其优势在于能正确有效地识别真核蛋白的合成、加工和分泌信号,识别和去除基因中的内含子,再经剪切加工成为成熟的mRNA,能准确地完成糖基化、磷酸化,形成链内和链间二硫键以及蛋白水解等翻译后加工过程,因而产生的完整抗体和天然抗体一样具有生物学活性,既可识别抗原又可激活补体系统。哺乳动物细胞易被重组的DNA转染,经过筛选可得到转化的细胞,具有遗传稳定性和可重复性,表达的产物分泌到培养基中易于纯化。利用哺乳动物细胞表达蛋白产物已广泛应用于生物制品工业,如病毒疫苗、抗体、干扰素、免疫调节剂、激素和生长因子等的大量制备。但哺乳动物细胞表达系统的缺点也很明显,如表达量低、大规模培养困难、生产成本高昂等。目前,国内应用哺乳动物细胞进行基因工程制药、抗体工程的研究多数停留在前期和上游阶段,进入实质性生产的极少。这种状况的产生主要因为构建的细胞株不适于大规模培养。因为工程细胞株除了要求目的蛋白的表达量高外,还必须适应无血清培养基培养;必须具有对不利环境的抵抗能力,如抗凋亡能力。工程细胞上述能力的获得仅由培养基配方和培养条件优化设计很难从根本上解决哺乳动物表达系统存在的问题,随着对细胞代谢途径和调控机理的深入研究,越来越多的研究者将研究方向转向针对细胞本身进行改造的代谢工程,通过代谢工程,从哺乳动物细胞内部重新设计改造细胞,使细胞更坚固,适应能力更强,具备在体外培养条件下的自身调节能力,从而适应产业化规模培养的要求。鉴于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是目前基因工程制药最常用的哺乳动物宿主细胞,本研究对CHO细胞的部分基因进行了过表达及调控表达,从不同角度多对CHO细胞进行了改造,以期获得上述能力。实验分成三部分。 1.构建共表达Cyclin D1/Survivin抗凋亡CHO工程细胞株无血清培养基或无蛋白培养基的诸多优点已使之取代了有血清培养基而成为大规模培养CHO细胞的首选培养基。由于没有血清提供生长因子和其它必需成分,细胞的生长增殖能力较差,而且很容易发生细胞凋亡。细胞周期蛋白D(Cyclin D)是一类G1期蛋白,在G1期表达持续增高,当达到一定量时,便推动细胞周期进入S期。所以CyclinD是细胞生长分裂的促进蛋白。我们试图通过过表达Cyclin D1蛋白而使细胞获得在无血清培养基中高活力生长的能力。为了抑制细胞凋亡,我们在细胞中同时过表达Survivin蛋白。Survivin是一种凋亡抑制因子,属于凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族的新成员。它包含3个内含子和4个外显子,表达一个分子质量为16.3kDa的蛋白。与其他同族的IPA不同,只有一个杆状病毒IAP重复(Baeuloviral IAP repeat,BIR)结构域。Survivin在细胞凋亡和细胞分化中有重要的调节作用,主要通过抑制Caspase-3和Caspase-7的活性而阻断细胞凋亡过程,具有很强的抗凋亡能力。我们应用双顺反子表达载体pIRES在CHO DG44细胞中同时表达Survivin蛋白及Cyclin D1蛋白。应用RT-PCR方法分别筛选到Survivin蛋白及Cyclin D1高表达克隆3个,分别为6号、13号、31号。对其进一步做Western blot和流式细胞分析,确认这三个细胞株分别高表Survivin蛋白及Cyclin D1蛋白。经同步化后用流式细胞术对三株阳性细胞株和对照细胞株进行周期测定,结果显示改造后的细胞有更多的细胞进入S期,用SPSS软件进行统计学分析,表明6号克隆、13号克隆及31号克隆都与对照细胞CHO DG44有显著性差异,这证明改造后的细胞有更强的分裂能力。通过加入Straurosporine而诱导细胞凋亡,以流式细胞术检测细胞凋亡,证明稳定转染重组质粒pISD的CHO DG44均具有较强的抗细胞凋亡能力。MTT法证明6号细胞株在不含血清的MEM培养基中的增殖活力显著高于CHO DG44对照细胞。提示改造后的细胞能够在无血清培养基中生长,并且具有较强的抗凋亡能力,具有作为生物工程宿主细胞的潜力。 2.应用四环素调控表达Survivin基因构建抗凋亡CHO细胞株如今无血清培养基或无蛋白培养基已取代了有血清培养基而成为大规模培养CHO细胞的首选培养基。由于没有血清提供生长因子和其它必需成分,细胞的生长增殖能力较差,而且很容易发生细胞凋亡。另外,在大规模动物细胞培养条件时,随着营养成分耗尽、有毒物质和代谢废物增多细胞会发生凋亡。为了抑制细胞凋亡,达到提高蛋白产量、质量及延长生产周期的目的,将抗凋亡基因Survivin导入CHO,其主要通过抑制Caspase-3和Caspase-7的活性而阻断细胞凋亡过程具有很强的抗凋亡能力。为了实现对Survivin蛋白表达的调控,利用T-RExTM(四环素诱导)系统,通过两步重组建立了稳定整合并能调控表达Survivin基因的重组细胞株。首先通过瞬时转染绿色荧光蛋白(EGFP)基因筛选到高表达Tet R的重组细胞株DG44-B2,在此基础上,定点整合受TetO2调控的Survivin基因,以实现对Survivin基因的调控表达,并筛选高表达Survivin蛋白的重组细胞株S9、S29、S31。用200μg/ml Zeocin以及8μg/ml Blasticidin筛选稳定克隆。用50mM NH4CI和Straurosporine进行凋亡诱导,然后分别用DNA Ladder法和流式细胞术对细胞凋亡进行检测,结果表明Tet调控Survivin蛋白表达的细胞株更能对抗不利的细胞培养条件。 3.适于无血清培养的宿主细胞系CHO-TD稳转株的构建铁是细胞生长必须的,转铁蛋白是运输铁离子的工具,它能够快速传递细胞生长所需的铁离子。另外,转铁蛋白也是一种生长因子,它能通过结合相应受体而刺激细胞生长,是工业化大规模细胞培养所应用的无血清培养基的重要组分。我们应用双顺反子表达载体pIRES在CHO DG44细胞中同时表达Transferrin蛋白及Cyclin D1蛋白,以期获得能在无血清培养基中生长的CHO细胞株。在本实验中我们成功构建了高表达Transferrin蛋白及Cyclin D1蛋白的细胞株CHO-TD。
[Abstract]:The present invention has the advantages of being capable of correctly and effectively recognizing the synthesis , processing and secretion signals of the eukaryotic protein , identifying and removing the intron in the gene , identifying and removing the intron in the gene ,

1 . Construction Co - expression of Cyclin D1 / Survivin Anti - apoptotic CHO Cell Line

The expression of Survivin and Cyclin D1 protein in CHO DG44 cells were detected by flow cytometry .

2 . Construction of Anti - apoptotic CHO Cell Lines with Survivin Gene Regulated by tetracycline

In order to improve the expression of Survivin protein and to prolong the production cycle , the recombinant cell line with high expression of Survivin protein can be regulated and regulated by means of two - step recombination .

3 . Construction of a CHO - TD Stable Strain of a Host Cell Line Suitable for Serum - free Culture

Iron is necessary for cell growth , transferrin is a tool for the transport of iron ions . It can rapidly transfer the iron ions needed for cell growth . In addition , transferrin is an important component of serum - free medium used in industrial large - scale cell culture .

【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R329

【参考文献】