超大容量人源噬菌体抗体库的构建及禽流感病毒抗体的筛选

发布时间：2018-04-14 07:29

本文选题：人源噬菌体抗体库 + Cre-loxP重组　；参考：《厦门大学》2008年硕士论文

【摘要】： 从20世纪70年代中期杂交瘤技术产生以来,人们一直对利用抗体作为疾病治疗的药物充满了期待。但应用鼠源杂交瘤抗体治疗人类疾病时,结果却令人相当失望。鼠源抗体分子在人体内会作为外来分子被人体免疫系统识别,从而产生人抗鼠抗体反应(human antimurine antibody response,HAM),鼠源抗体在体内引起过敏反应并很快的被人体免疫系统清除掉,从而无法到达治疗的目的。而后一系列的人源抗体技术,为解决这一问题带来了曙光。伴随着鼠抗人源化、人B细胞永生化和抗体基因工程技术的逐渐成熟,不少治疗性抗体也陆续进入临床研究,甚至已经成为上市药物。噬菌体展示抗体库技术因为操作简单,及筛选高通量,成为最便捷最高效的人源抗体技术之一。但是通过常规技术制备的噬菌体抗体库,由于PCR、连接、转化效率等原因,限制了噬菌体抗体库的容量。此外,由于构建的抗体库不能像抗体基因在体内一样,可以发生重排,抗体库的多样性常常受到限制。缺乏多样性的抗体库经过筛选往往不能获得亲和力高、特异性好的克隆。因此,得到库容量高、多样性丰富的抗体库非常重要。而体外重组系统的建立,有利于增加抗体库的多样性。本研究利用72对兼并引物扩增了人抗体可变区基因,通过摸索PCR扩增条件、优化制备电转感受态、提高连接物浓度,成功构建了一个具有良好基因多样性的人源天然噬菌体抗体库,库容为1.47×10~7,并通过菌株改造和突变loxP位点的应用,建立了适于抗体库的Cre-loxP重组系统,使得在Cre酶的作用下不同scFv基因间的VH、VL进行重组,抗体轻重链能够自由随机的组合重排,重组过程可以无限重复,每一次重组的产物都可以作为下次重组的底物,便于以后的筛选和亲和力成熟,最后获得8×10~11超大容量的噬菌体单链抗体库,建立了超大容量抗体库抗体库制备人源抗体的技术平台,为以后针对各种病毒、病原菌、毒素等抗原进行筛选,获得特异性人源治疗性单抗奠定了基础。抗体在阻止病毒入侵宿主细胞,抑制病毒复制方面起着重要的作用。人源抗体技术的发展,也为病毒性疾病的治疗带来了新的亮点。本研究通过固液相及不同H5N1型禽流感病毒株对抗体库进行筛选,经过多毒株三轮淘洗,洗脱下来的噬菌体抗体呈明显增加趋势,表明对病毒HA的噬菌体抗体得到了有效的富集。利用ELISA和HAI等检测手段,获得9株抗体并进行原核表达获得scFv抗体蛋白。其中4株抗体能与H5亚型三株病毒交叉反应,4株中的一株抗体还表现出对H1、H3、H5亚型毒株的强交叉。有望成为禽流感抗体药物,用于高致病性高死亡率流感的治疗。此外,可以用这些抗体寻找HA1上的保守表位,研究流感病毒突变机制,研制通用疫苗。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

【参考文献】