大鼠卡氏肺孢子菌kexin基因克隆及融合蛋白的免疫特性研究
本文选题:卡氏肺孢子菌 + kexin基因 ; 参考:《南通大学》2009年硕士论文
【摘要】:目的:体外扩增大鼠卡氏肺孢子菌kexin基因全长DNA序列,选取具有优势抗原表位的片段构建原核表达载体并诱导表达重组蛋白,免疫实验动物,检测该蛋白的免疫学特性。方法:根据已报道大鼠卡氏肺孢子菌kexin基因cDNA序列,设计引物,扩增卡氏肺孢子菌kexin基因全长DNA序列;通过生物信息学方法选择具有优势表位的kexin基因片段,通过基因克隆技术分别构建pGEX-kexin及pET-kexin重组表达质粒;用IPTG分别诱导表达融合蛋白(GST-kexin、His-kexin);将融合蛋白His-kexin经透析袋电泳法纯化后作为抗原,免疫小鼠,GST-kexin蛋白经纯化后作为检测用抗原,测定其免疫指标。应用western blot鉴定kexin融合蛋白的免疫原性;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中特异性抗体水平;淋巴细胞转化试验(MTT法)检测淋巴细胞增殖水平。结果:PCR扩增kexin基因获得DNA序列全长为2605bp,成功提交美国NCBI GenBank数据库(序列号为EU711053)。选取的kexin基因片段分别构建重组质粒pGEX-kexin及pET-kexin,经PCR、酶切及测序等方法鉴定表明两种表达质粒构建成功,且两种表达质粒中目的片段完全一致。诱导表达的GST-kexin蛋白分子量约为43kDa,His-kexin蛋白分子量约为23kDa。以融合蛋白His-kexin免疫小鼠,获得的小鼠血清,经ELISA及western blot分析能够特异性识别GST-kexin蛋白。免疫后小鼠脾细胞经GST-kexin蛋白刺激后,His-kexin蛋白免疫组的刺激指数较对照组显著增高(分别为1.763±0.164;1.01±0.051)。结论:本研究成功克隆了kexin基因,构建了pGEX-kexin及pET-kexin原核表达载体,诱导表达了GST-kexin及His-kexin融合蛋白。His-kexin融合蛋白能诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫应答。
[Abstract]:Aim: to amplify the full-length DNA sequence of Pneumocystis carinii kexin gene in vitro, construct the prokaryotic expression vector and induce the expression of recombinant protein by selecting the fragment with dominant antigen epitope.Methods: according to the reported cDNA sequence of Pneumocystis carinii kexin gene, primers were designed to amplify the full-length DNA sequence of Pneumocystis carinii kexin gene, and kexin gene fragments with dominant epitopes were selected by bioinformatics.The recombinant expression plasmids of pGEX-kexin and pET-kexin were constructed by gene cloning technique, the fusion protein GST-kexin His-kexinine was induced by IPTG, the fusion protein His-kexin was purified by dialysate bag electrophoresis as antigen, and the GST-kexin protein of immunized mice was purified as detection antigen.Its immune index was determined.Western blot was used to identify the immunogenicity of kexin fusion protein, Elisa was used to detect the specific antibody level in mouse serum, and lymphocyte transformation assay was used to detect lymphocyte proliferation.Results the total length of kexin gene was 2605 BP, which was successfully submitted to the US NCBI GenBank database (sequence number EU711053).The recombinant plasmids pGEX-kexin and pET-kexin were constructed by PCR, restriction endonuclease digestion and sequencing, respectively. The results showed that the two expression plasmids were constructed successfully, and the target fragments of the two plasmids were identical.The molecular weight of the induced expression of GST-kexin protein was about 43kDaHis-kexin protein and the molecular weight of the protein was about 23kDa.Mice were immunized with the fusion protein His-kexin. The obtained serum could specifically recognize the GST-kexin protein by ELISA and western blot analysis.The stimulation index of His-kexin protein immunized group was significantly higher than that of the control group (1.763 卤0.164 卤1.01 卤0.051).Conclusion: kexin gene was cloned successfully, pGEX-kexin and pET-kexin prokaryotic expression vectors were constructed, and GST-kexin and His-kexin fusion protein. His-kexin fusion protein could induce specific humoral and cellular immune responses in mice.
【学位授予单位】:南通大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R392
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