肾上腺髓质素基因腺病毒表达载体的构建及其对骨髓间充质干细胞增殖的影响

发布时间：2018-04-21 07:06

  本文选题：腺病毒 + 载体　； 参考：《福建医科大学》2008年硕士论文

【摘要】： 目的 构建表达大鼠肾上腺髓质素(AM)基因的重组腺病毒载体,探讨其对骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖的影响。 方法 设计带酶切位点NotI ,HindⅢ的引物,以大鼠肾脏组织总RNA为模板,经RT-PCR扩增获得AM基因全部序列并定向克隆至穿梭载体pShuttle-CMV,构建出重组穿梭质粒pShuttle-CMV-AM,经过NotI ,HindⅢ双酶切和DNA测序鉴定后,利用pShuttle-CMV-AM和腺病毒骨架载体pAdEasy-1在细菌BJ5183菌体内进行同源重组,卡那霉素筛选,构建出重组腺病毒质粒rhAdEasy-AM,重组腺病毒质粒经PacI酶切鉴定和PCR鉴定后,在工程菌XL 10-Gold菌体内大量扩增,重组腺病毒质粒后转染AD-293细胞,在AD-293细胞内进行腺病毒的包装扩增,制备病毒上清并测定其滴度,并感染大鼠骨髓间充质干细胞,用MTT方法评估其对MSCs增殖的影响。 结果 将AM cDNA正向连接到穿梭载体pShuttle-CMV上,NotI ,HindⅢ双酶切能切出579bp的的片段,DNA测序结果与Genebank上AM基因编码区完全一致,该重组质粒与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在细菌BJ5183菌体内成功进行同源重组,并经PacI酶切鉴定,得到带有目的基因的大小为3.Okb或4.5kb的穿梭质粒的片段,测得重组腺病毒感染性滴度为1×10~9pfu/ml,经Western blot检测,AM在MSCs里有表达。并能够在低氧条件促进其增殖(缺氧组与缺氧+AM组相比,P0.01)。 结论 本实验成功构建出携带AM cDNA的真核表达载体重组腺病毒rhAdEasy-AM;并且用该重组腺病毒对骨髓间充质干细胞进行转染,证明导入的AM基因可以在骨髓间充质干细胞中表达AM蛋白,并能够在低氧条件促进其增殖。
[Abstract]:Purpose A recombinant adenovirus vector expressing rat adrenomedullin (AMN) gene was constructed to investigate its effect on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs). Method Using the total RNA of rat kidney tissue as template, the whole AM gene sequence was amplified by RT-PCR and cloned into shuttle vector pShuttle-CMV. The recombinant shuttle plasmid pShuttle-CMV-AMwas constructed. The recombinant shuttle plasmid pShuttle-CMV-AMwas identified by NotI Hind 鈪，

本文编号：1781409