空肠弯曲菌pcDNA3.1（-）-peb1A构建及免疫原性研究

发布时间：2018-04-25 03:22

  本文选题：空肠弯曲菌 + peblA基因　； 参考：《遵义医学院》2009年硕士论文

【摘要】： 目的:构建空肠弯曲菌peb1A基因真核表达载体并在COS-7细胞中进行表达,初步探讨重组质粒的免疫原性及壳聚糖的免疫佐剂作用。方法:(1)真核表达载体的构建及鉴定:以PET28a(+)-peb1A为模板,PCR扩增空肠弯曲菌peb1A基因,扩增产物和质粒pcDNA3.1(-)分别经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,回收后用T4连接酶连接得到重组质粒pcDNA3.1(-)-peb1A,转化E.coli DH5α,Amp平板筛选阳性克隆,提取重组质粒进行双酶切、PCR和测序鉴定。(2)重组质粒在COS-7细胞中的表达:重组质粒pcDNA3.1(-)-peb1A经抽提后采用jetPEI~(TM)阳离子聚合物转染试剂转染COS-7细胞,Western Blot鉴定重组蛋白的表达。(3)重组质粒的免疫原性研究:健康雄性昆明小鼠分为实验组和对照组。实验组设pcDNA3.1(-)-peb1A组和壳聚糖-pcDNA3.1(-)-peb1A组,均设50μg/100μl、100μg/100μl、200μg/100μl(按DNA含量计算)三个剂量组;对照组设空载体pcDNA3.1(-)(100μg/100μl)对照组和生理盐水(NS)对照组。各组均采用小鼠股四头肌注射法。A方案在第0、10、20天免疫,B方案在第0、15、25、35天免疫,均于每次免疫后第10天采集各组小鼠血清,并分离各组小鼠脾淋巴细胞包被细胞培养板。以间接ELISA法检测血清中IgM、IgG的含量,选择最佳免疫原剂量和免疫方案。以细胞ELISA法检测优选组小鼠脾淋巴细胞CD20、CD21表达水平。结果:(1)peb1A基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,为大小约812bp的单一条带。重组质粒pcDNA3.1(-)-peb1A经双酶切和PCR鉴定,构建正确。peb1A基因测序结果与GenBank中peb1A基因序列一致。(2)重组质粒成功转染COS-7细胞,并能在COS-7细胞表达重组蛋白。(3)裸DNA组和壳聚糖-DNA组各剂量组IgG水平均高于两对照组,有显著性差异(P＜0.05)。裸DNA组和壳聚糖-DNA组IgG水平100μg剂量均高于50μg剂量及200μg剂量,有显著性差异(P＜0.05)。壳聚糖-DNA组100μg剂量IgG水平高于裸DNA组100μg剂量,有显著性差异(P＜0.05)。A方案IgG最高水平高于B方案IgG最高水平,有显著性差异(P＜0.05)。小鼠脾淋巴细胞CD20、CD21表达水平,裸DNA组和壳聚糖-DNA组均高于两对照组,有显著性差异(P＜0.05),壳聚糖-DNA组高于裸DNA组,有显著性差异(P＜0.05)。结论:成功构建了空肠弯曲菌peblA基因真核表达载体并能在COS-7细胞中表达。重组质粒pcDNA3.1(-)-peb1A经肌肉注射免疫小鼠,具有较好的免疫原性,最佳免疫原剂量为100μg,A免疫方案优于B免疫方案。壳聚糖能增强pcDNA3.1(-)-peblA的免疫原性,有望成为CJ基因疫苗的候选佐剂。
[Abstract]:Aim: to construct eukaryotic expression vector of peb1A gene of Campylobacter jejuni and express it in COS-7 cells. Methods the eukaryotic expression vector was constructed and identified. The peb1A gene of Campylobacter jejuni was amplified by using PET28a as template, and the amplified product and plasmid pcDNA3.1 ~ (-1) were digested by EcoR 鈪，

本文编号：1799537